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無需抗體的酶輔助化學標記N6-甲基腺嘌呤（m6A）測序技術
隨著首個RNA修飾N6-甲基腺嘌呤（m6A）的去修飾酶FTO的發(fā)現，RNA表觀遺傳學/表觀轉錄組學開始興起并成為表觀遺傳學新的研究熱點。m6A作為首個被發(fā)現的可逆RNA修飾，廣泛存在于mRNA，依賴修飾酶、去修飾酶和結合蛋白發(fā)揮調控功能。已發(fā)現m6A具有調控mRNA剪接、出核、穩(wěn)定性和蛋白翻譯等功能，可以參與發(fā)育、配子發(fā)生、細胞重編程、生物節(jié)律、疾病等多種生理和病理過程的功能調控。為了更好地研究m6A生物功能和臨床病理研究，開發(fā)m6A高通量測序技術一直是研究的熱點。 現有m6A測序技術主要依賴于m6A抗體富集技術，包括低分辨率的m6A-seq/MeRIP-seq和聯用iCLIP或PAR-CLIP技術的高分辨率m6A測序技術miCLIP 或PA-m6A-seq。抗體存在對特定RNA序列或結構的潛在非特異性結合，為了解決抗體方法的種種問題，研究者們做出了各種嘗試，近期開發(fā)了兩類無需抗體的m6A測序技術，一類為利用對特定甲基化序列（m6ACA）敏感的RNA核酸內切酶MazF輔助的測序方法（m6A-REF-seq or MAZTER-seq），此類方法只能檢測16~25%的m6A位點；另一種是在細胞內表達融合m6A-binding domain（YTH）與胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）的融合蛋白實現的m6A測序（DART-seq），但該方法依賴于細胞轉染效率且受限于體外樣品的使用。 賈桂芳課題組一直致力于開發(fā)和利用核酸化學生物學技術研究RNA化學修飾在動植物中的生物功能研究。在本課題中，賈桂芳課題組巧妙地利用m6A的去甲基酶FTO蛋白作為催化劑，將mRNA上化學惰性的m6A轉化為高反應活性的中間態(tài)產物N6-羥甲基腺嘌呤（hm6A），然后利用二硫蘇糖醇（DTT）的巰基與hm6A發(fā)生亞胺1,2加成反應，將不穩(wěn)定的hm6A轉化為更穩(wěn)定的巰基加成產物dm6A。dm6A上的自由巰基可以與甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反應，實現在mRNA上m6A的位置標記生物素Biotin，最終可被鏈霉親和素珠捕獲，從而富集含有m6A修飾的RNA片段供后續(xù)高通量測序使用。
北京大學
2021-04-11
關于冷凍電鏡解析的人源蛋白酶體組裝的變構選擇機制
蛋白酶體是細胞用來調控特定蛋白質的濃度和清除錯誤折疊蛋白質的主要機制，是細胞中最普遍的不可或缺的大型 蛋白復合機器之一，也是迄今為止發(fā)現的最大的蛋白降解機器。 蛋白酶體全酶是由蓋子 (Lid)和基座(Base)亞復 合體組成的調控顆粒RP(Regulatory Particle)所激活。基座亞復合體在組裝過程中最重要的一個步驟是異質六 聚AAA-ATPase環(huán)的組裝。這個過程至少需要被PAAF1, p28/gankyrin, p27/PSMD9和S5b這四種調控顆粒(RP)組 裝伴侶蛋白分子所引導。天然的自由態(tài)19S調控復合體的構象存在大量的亞穩(wěn)定態(tài)，并表現出大幅度的局部構象漲 落，使冷凍電子顯微鏡技術成為解析其結構的唯一手段。利用 冷凍電鏡解析人源蛋白酶體全酶的基礎上（見PNAS 2016, 113: 12991-12996），利用他們自主開發(fā)的基于統(tǒng)計 流行算法的高性能計算軟件ROME（見PLoS ONE 2017, 12:e0182130）與優(yōu)化的冷凍電鏡處理方法對p28-RP復合 體細微動態(tài)構象進行深度分類，共解析出了1個4.5-? p28綁定的調控顆粒（RP）非AAA的亞復合體，3個近7-? p28 綁定的完整RP結構，1個亞納米精度下的非p28綁定的完整RP結構以及7個亞納米精度下的由Rpn1-p28-AAA組成的p28 綁定RP的亞復合體的動態(tài)構象。觀察到自由態(tài)RP調控顆粒中p28-綁定的AAA環(huán)并沒有組成的閉 環(huán)孔狀通道，而是自發(fā)地在Rpt2-Rpt6和Rpt3-Rpt4界面上形成多個由“開”到“關”的拓撲變構。
北京大學
2021-04-11
一種新型透明質酸和硫酸軟骨素超級裂解酶
本項目涉及一種新型的超級糖胺聚糖裂解酶 HCLase. 通過對提取的外周血基因組 DNA 與目的基因 GSTM3 啟動子的甲基化特異 性引物對和探針、內參基因 ALU-C4 的特異性引物對和 Taqman 熒光探針序列， 對處理過的 DNA 進行實時定量聚合酶鏈式（PCR）反應,用甲基化特異性 PCR 205 的方法檢測目的基因 GSTM3 和內參基因 ALU-C4 的閾值循環(huán)值，并計算出基 因 GSTM3 甲基化定量值。有助于評估病情、判斷預后及指導治療。
山東大學
2021-04-13
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適用于呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒
研發(fā)階段/n本成果合成了人工免疫原和包被原，制備出高效價的特異性抗體，建立了肌肉(豬、雞、魚)、肝臟(豬、雞)、腎臟(豬)中AOZ殘留檢測的ELISA方法，并與建立的多殘留檢測HPLC方法進行了對比。該方法的檢測限、回收率、變異系數均達到我國獸藥殘留快速檢測的要求。以上述方法為基礎，在國內首次研制出動物樣品中AOZ殘留檢測ELISA試劑盒。通過與國外同類試劑盒、HPLC法的比對和動物殘留試驗證明，該試劑盒的靈敏度、準確度和重現性與國外試劑盒水平相當。經多家檢測機構和研究單位的復核和應用表明，該試劑盒
華中農業(yè)大學
2021-01-12
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一種提純大腸桿菌表達的重組黃曲霉尿酸氧化酶的方法
研發(fā)階段/n本發(fā)明公開了一種從高效表達的基因工程菌中提取重組黃曲霉尿酸氧化酶的方法。該菌是攜帶重組質粒的大腸桿菌Rosetta(DE3)，該重組質粒是含黃曲霉尿酸氧化酶uricase基因的質粒pET-30c(+)。用該菌生產黃曲霉尿酸氧化酶的方法包括四個步驟：A、工程菌發(fā)酵，累積胞內尿酸氧化酶；B、超聲波破胞，離心收集上清液（含可溶性尿酸氧化酶）；C、依次進行離子交換層析、疏水層析及凝膠過濾層析，收集活性峰；D、將活性峰冷凍干燥，即得高純度的重組黃曲霉尿酸氧化酶。本發(fā)明的優(yōu)點：生產重組黃曲霉尿酸氧化
湖北工業(yè)大學
2021-01-12
東南大學張袁健團隊在納米酶催化機制方面取得重要研究成果
近日，東南大學化學化工學院、江蘇省富碳材料器件工程研究中心張袁健教授團隊（https://carbosensing.group）在Fe-N-C納米酶在催化抗壞血酸氧化反應中的機制研究取得進展，相關成果以“Insights into Iron Leaching from an Ascorbate-Oxidase-like Fe-N-C Nanozyme and Oxygen Reduction Selectivity”為題在化學領域國際權威學術期刊Angew. Chem. Int. Ed.以VIP Paper形式在線發(fā)表。
東南大學
2023-05-15
一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的液體發(fā)酵方法
本發(fā)明公開了一種海洋黑曲霉生產耐鹽纖維素酶的液體發(fā)酵方法。包括如下步驟:1)從東海近海10～20m深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉;2)海洋黑曲霉接種于PDA培養(yǎng)基上,32～40℃下培養(yǎng)60～90小時,得到斜面孢子,斜面孢子保藏于4℃;3)斜面孢子接種于PDA-1培養(yǎng)基,在32～40℃下培養(yǎng)60～90h,得到活化的孢子;4)活化的孢子接種于茄子瓶斜面,42℃培養(yǎng)74小時,得到擴培的茄子瓶斜面孢子;5)擴培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌人工海水稀釋到108個孢子/ml,接種于液體發(fā)酵產酶培養(yǎng)基,發(fā)酵5～10天,得到纖維素酶。本發(fā)明具有產酶活高、酶穩(wěn)定、耐鹽性好等優(yōu)點,生產的纖維素酶可以在較高鹽含量的條件下降解纖維素,為該水解物的后續(xù)應用打下基礎。
浙江大學
2021-04-13
一類具酪氨酸酶抑制活性的化合物的制備方法與用途
本發(fā)明提供一類具有酪氨酸酶抑制活性的化合物的制備方法，包括六種從桑葉中提取的具有酪氨酸酶抑制活性的多酚類化合物。通過將藥材經乙醇水溶液加熱提取，濃縮，硅膠柱分離，洗脫，洗脫液濃縮干燥，再用制備液相色譜繼續(xù)分離，收集溶液，溶液濃縮干燥后得到樣品并進行結構鑒定。本發(fā)明還提供了從桑葉中分離上述多酚類化合物的方法。本發(fā)明提供的六種多酚類化合物具有較強的酪氨酸酶抑制活性，能夠有效預防和治療黑色素合成異常導致的人體色素沉著性疾病、黑色素瘤以及其它需要抑制酪氨酸酶活性的病癥，可用于制備治療此類疾病的藥物。
浙江大學
2021-04-13
(R)-硫辛酸手性中間體的綠色酶法不對稱合成技術
(R)-硫辛酸是一種能消除老化與致病的類似維他命的物質，可以去除機體自由基，促進機體利用葡萄糖合成維生素C，能有效去除黑色素，還可協(xié)助輔酶進行有利于機體免疫力的生理代謝，是一種萬能抗氧化劑藥物，廣泛應用于預防和治療心臟病、糖尿病及老年癡呆癥。而近年來歐美國家開始將其應用于食品、保健品及化妝品，應用范圍的擴展為其市場增長提供了廣闊的空間。目前 (R)-硫辛酸的生產主要是通過化學拆分法合成 (化學拆分法合成途徑) ，即先通過化學法合成混旋硫辛酸，再利用苯乙胺作為拆分劑對其進行拆分，得到的右旋硫辛酸苯乙胺鹽，經鹽酸脫鹽得到 (R)-硫辛酸粗品，精制后即可得到合格的 (R)-硫辛酸。但由于該法工藝復雜，需要多次結晶，成本高、理論得率僅為50%。
本技術利用酶法不對稱還原8-氯-6-羰基辛酸乙酯制備 (S)-8-氯-6-羥基辛酸乙酯，再結合化學法合成 (R)-硫辛酸的工藝路線 (化學-酶法合成途徑) ，可使 (R)-硫辛酸的合成步驟由化學-拆分法的9步縮減到化學-酶法的6步、產品收率提高40%、生產成本降低20%，而且也顯著地減少了原料消耗和廢物排放，是典型的環(huán)境友好的綠色合成工藝。合成的最終產品 (R)-硫辛酸的光學純度在99%以上，其產業(yè)化更具有經濟效益、更符合綠色技術的要求。
華東理工大學
2021-04-13
氯吡格雷手性前體(R)-鄰氯扁桃酸甲酯的酶法制備
氯吡格雷 (Clopidogrel) ，商品名波立維 (Plavix) ，是抑制血小板聚集的藥物。年銷售額超過百億美元，是目前世界上排名第二位的重磅炸彈級藥物。
(R)-鄰氯扁桃酸甲酯是氯吡格雷原料藥合成的重要前體化合物，酶促鄰氯苯甲酰甲酸甲酯不對稱還原是制備 (R)-鄰氯扁桃酸甲酯的重要方法，具有轉化率高、產品光學純度好、環(huán)境污染小等顯著優(yōu)點。
本項目我們通過廣泛篩選，獲得一個高立體選擇性的羰基還原酶，將其與葡萄糖脫氫酶共克隆表達于大腸桿菌中，使用重組大腸桿菌整細胞在單水相體系中高效催化鄰氯苯甲酰甲酸甲酯的不對稱還原，使用廉價的葡萄糖作為輔底物，反應體系中無需額外添加價格昂貴的輔酶，反應體系簡便，原料成本低廉。底物濃度可高達600 g/L，完全轉化，產物 (R)-鄰氯扁桃酸甲酯的得率高于90%，光學純度高于99.9%。具有很好的產業(yè)化前景。
華東理工大學
2021-04-13