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該專利首次公開了三種偏甘油酯脂肪酶突變體及其制備方法,解決了偏甘油酯脂肪酶在實際生產及應用中所存在熱穩定性差的國際性技術難題。專利技術在廣東溢多利生物科技股份有限公司實施生產，開發形成系列濃縮復合酶產品，成功用于養殖、食品及造紙等行業中，成功出口東南亞、南亞、南北美洲、東歐和韓國、中國臺灣、澳洲等多個“一帶一路“沿線國家及地區，并被當地用戶所普遍接受和認可。截至2017年12月，所開發的產品累計為企業帶來銷售額接近1.8億元，利稅近2700萬元。獲得了中國專利優秀獎和廣東專利金獎。

一步酶法從頭孢菌素 c（CPC） 生產 7－氨基頭孢烷酸（ 7-ACA） 是繼我們研發的兩步酶法工藝成功應用于工1 成果簡介一步酶法從頭孢菌素 c（CPC） 生產 7－氨基頭孢烷酸（ 7-ACA） 是繼我們研發的兩步酶法工藝成功應用于工業生產以后，在生產頭孢菌素類抗生素醫藥中間體技術的又一個突破。與化學法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡單、環保和轉化率高、產品質量好等優點。該技術采用基因工程技術對 CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構建的高效啟動子 HP 以及優化組合的調控表達元件，構建并篩選出了能夠高效、高活性表達一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細胞株。這是國內第一個使得 CPC 酰化酶活性能夠達到工業應用水平的技術。由于采用了高效的表達系統和穩定的質粒，以及組成型表達結構，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩定，在發酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導劑就可以實現高效、高活性表達。在高效表達 CPC 酰化酶的基礎上，我們通過在表達基因上同時引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進行。通過自己開發研制的可重復使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達到 60U/g 以上。固定化酶可以重復使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復使用。2 技術指標菌 種：基因工程大腸桿菌，卡那抗性，組成型表達。 發酵溫度： 37℃ 培 養 基：普通的大腸桿菌培養基，主要成分有玉米漿等廉價的營養源。 發酵周期： 20 小時 發酵酶活： 3U/ml 以上（ 5 升發酵罐） 特 點：遺傳特性穩定，不需要添加誘導劑和抗生素，工藝簡單。3 合作方式小試技術轉讓或合作進行中試。4 所屬行業領域醫療衛生。業生產以后，在生產頭孢菌素類抗生素醫藥中間體技術的又一個突破。與化學法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡單、環保和轉化率高、產品質量好等優點。該技術采用基因工程技術對 CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構建的高效啟動子 HP 以及優化組合的調控表達元件，構建并篩選出了能夠高效、高活性表達一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細胞株。這是國內第一個使得 CPC 酰化酶活性能夠達到工業應用水平的技術。由于采用了高效的表達系統和穩定的質粒，以及組成型表達結構，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩定，在發酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導劑就可以實現高效、高活性表達。在高效表達 CPC 酰化酶的基礎上，我們通過在表達基因上同時引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進行。通過自己開發研制的可重復使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達到 60U/g 以上。固定化酶可以重復使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復使用。

一步酶法從頭孢菌素c（ CPC） 生產7－氨基頭孢烷酸（7-ACA） 是繼我們研發的兩步酶法工藝成功應用于工業生產以后，在生產頭孢菌素類抗生素醫藥中間體技術的又一個突破。與化學法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡單、環保和轉化率高、產品質量好等優點。該技術采用基因工程技術對 CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構建的高效啟動子 HP 以及優化組合的調控表達元件，構建并篩選出了能夠高效、高活性表達一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細胞株。這是國內第一個使得 CPC 酰化酶活性能夠達到工業應用水平的技術。由于采用了高效的表達系統和穩定的質粒，以及組成型表達結構，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩定，在發酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導劑就可以實現高效、高活性表達。在高效表達 CPC 酰化酶的基礎上，我們通過在表達基因上同時引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進行。通過自己開發研制的可重復使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達到 60U/g 以上。固定化酶可以重復使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復使用。

(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯用于合成多種血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)普利藥物，如貝 那普利、西拉普利等，該類藥物用于治療高血壓。在抗高血壓藥物市場中，ACEI與非肽類血 管緊張素II (AngII)受體抑制劑、鈣通道拮抗劑(CCB)形成了三足鼎立的市場格局。該類藥物 2009年的世界銷售為52億美元，國內市場約30億元人民幣，國內外對普利原料藥需求旺盛，價 格穩定，尤其是貝那普利等緊俏產品，主要依賴進口，國內外前景樂觀。目前，我國在卡托普 利、依那普利、賴諾普利、雷米普利、喹那普利、貝那普利和福辛普利等8個普利藥物實現了 產業化。傳統的生產(R)-HPBE的方法為化學法，存在催化劑較昂貴且污染環境、產物光學活 性低、對設備壓力要求高等缺點，本項目采用的生物法，綠色無污染，催化劑成本低，產物光 學活性高，操作簡單，條件溫和，具有很好的市場前景。 本項目開發了一種酶促不對稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制備多種普利類藥物關鍵手性 中間體(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的生物技術。該技術易于放大，反應溫和(30℃，pH 6.0)，產 品光學純度高(>99%)，收率85%，且不需要添加昂貴的輔酶再生系統。項目的實施將節能減排 20-30%，生產成本降低20%以上，產品收率提高15%，顯示了該項技術具有很好的工業應用前 景。

本發明公開了一種斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其編碼的蛋白質與用途，本發明所提供的鯊烯合酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所示基因編碼的蛋白質具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。本發明提供的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因可以通過基因工程技術提高斜生纖孔菌中樺褐孔菌醇的含量，可用于利用轉基因技術來提高斜生纖孔菌中樺褐孔菌醇含量的研究和產業化中。而這些次生代謝產物在臨床上具有巨大的應用價值，對保護人民的健康生長有所幫助。因而本發明具有很大的應用前景。

包蟲病是由棘球絳蟲寄生于人體或宿主動物而引起的嚴重寄生蟲疾病。而我國是同時有囊型和泡狀兩種類型的包蟲病高發區。目前臨床應用最廣泛的抗包蟲病藥物是阿苯達唑，但是該藥的腸道吸收率很差，而且其一般只能抑制寄生蟲生長而不能徹底有效殺滅寄生蟲，導致患者必須長期大量服用該藥物才能達到治療效果。與此同時，大量的研究發現該藥可引起多系統的嚴重藥物不良反應。因此，尋找或開發療效顯著且副作用小的包蟲病治療新藥物具有重大的意義。 棘球絳蟲獲取能量的主要方式通過糖酵解過程。而甘油醛 3-

帕金森病是一種是老年人群中常見的慢性、進行性、運動障礙性中樞神經系統疾病。帕金森病主要是由于大腦中缺乏多巴胺引起的．左旋多巴(Levodopa，L-dopa)為目前治療帕金森病的主要藥物．多巴胺不能夠通過血腦屏障到達大腦治療帕金森病，而 L-dopa 能夠通過血腦屏障，到達中樞神經系統，并在體內脫羧酶的作用下轉變為多巴胺，從而治療帕金森病．常見的治療帕金森病的藥物多為 L-dopa 及其與其他藥物的復合物，如美多芭、息寧等。在全球 500 強暢銷藥物市場中，抗帕金森治療市場超過 20 億美元。 來源于大腸桿菌的 4-羥基苯乙酸-3-羥化酶（ p-hydroxyphenylacetate3-hydroxylase ，PHAH) 具有較寬的底物范圍，可以將 L-酪氨酸轉化為 L-dopa，反應單向進行，產物均為 L 型，且該酶不會進一步氧化 L-dopa。但由于 L-酪氨酸并不是 PHAH 的最適底物，該方法催化生成 L-dopa 反應速率慢，到目前文獻報道的最高產率為 12.5g/L，并不能實際生產應用。 前期本實驗室通過對大腸桿菌芳香族氨基酸代謝途徑進行改造，已獲得從葡萄糖發酵生成 L-酪氨酸高產大腸桿菌菌株，發酵水平僅次于美國麻省理工學院與美國杜邦合作文獻報道的 L-酪氨酸發酵水平.本課題對 4-羥基苯乙酸-3-羥化酶進行突變改造，獲得了一催化反應速度大幅提升的突變體。在 L-酪氨酸的代謝途徑的基礎上，含 4-羥基苯乙酸-3-羥化酶突變體的大腸桿菌培養 38 小時轉化生成左旋多巴產率即可達 50g/L 以上，且培養發酵簡單易行為世界上首個采用此法可實現大規模工業應用的左旋多巴生產路線。目前左旋多巴市場價格約為50 萬/噸，此法生產成本遠低于左旋多巴市場價格。

報道了pre-tRNA結合人源tRNA剪接內切酶 (tRNA splicing endonuclease, TSEN) 復合物處于“預催化”和“催化后”兩種狀態的高分辨率結構，結合體外生化，揭示了TSEN復合物識別和剪切pre-tRNA內含子的分子機理。