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該項目 成功 構建 了 一株高 產堿 性果 膠 酶的畢 赤酵 母工 程 菌 (Pichia pastoris GS115),通過對發酵過程的優化控制，在 3L 罐中酶活達到 890U/mL。 在此基礎上進行了堿性果膠酶的中試及其工業化研究，在 10 噸發酵罐中產酶達到 1305U/mL.采用該重組堿性果膠酶代替傳統的強堿高溫工藝，廢水 COD 顯著降低，可生化性較大提高。處理體系 pH 值為 9.4，代于堿精練水平；酶處理溫度低于堿處理，這些結果對棉織物前處理的清潔生產具有重要的應用價值。 

本發明達到的技術效果為工程化釀酒酵母菌可實現無需添加異源前體物或底物僅通過培養微生物即可從頭合成高效人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1等三種齊墩果烷型稀有人參皂苷以及金盞花苷E。 一、項目分類 關鍵核心技術突破 二、技術分析 人參皂苷Ro 是人參的主要活性成分之一，具有多種藥理、生理活性,在人參中含量較低（約0.4%），無法滿足日益增長的市場需求，而利用微生物從頭合成人參皂苷Ro則可以有效解決該問題，顛覆傳統的獲取方式，然而合成途徑未知，目前尚未有利用微生物從頭合成的報道。 本發明技術方案：1.通過生物信息學分析，對現有數據庫中的多種植物基因組、轉錄組數據進行分析和比對，初步篩選候選基因，再結合前期經驗和實驗基礎通過進化樹分析、同源建模、分子對接、保守序列分析等手段，確定最終的候選基因；2.通過酶工程等手段，對候選基因進行重組表達、體外酶活驗證、底物譜驗證等，挑選最合適的酶；3.通過合成生物學、代謝工程、分子生物學相關技術手段，對相關酶進行質粒構建、底盤宿主代謝網絡調控、異源途徑整合，最終成功構建人參皂苷Ro微生物細胞工廠。 本發明解決了人參皂苷Ro天然代謝途徑未知、異源途徑與底盤宿主適配性、已報道相關酶活性低等關鍵技術問題。本發明達到的技術效果為工程化釀酒酵母菌可實現無需添加異源前體物或底物僅通過培養微生物即可從頭合成高效人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1等三種齊墩果烷型稀有人參皂苷以及金盞花苷E。 本發明創新點包括：1.通過基因挖掘手段獲得的關鍵酶性能遠遠優于已報道的酶；2.通過基因挖掘手段獲得的多個關鍵酶，實現了人參皂苷Ro的合成途徑構建；3.首次實現了利用微生物從頭合成人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1等三種齊墩果烷型稀有人參皂苷以及金盞花苷E。 齊墩果烷型稀有人參皂苷，由于其豐富且具備一定特殊性的藥理、生理活性，可作為現有人參皂苷市場的強力補充，應用前景廣闊。而其天然含量極低，利用微生物對其進行從頭合成可大大降低生產成本與產物分離純化難度，減少有機試劑用量，不依賴植物種植，周期更短，符合國家綠了環保、可持續發展的硬性要求，微生物綠色制造是當前的政策導向也是發展的必然趨勢。

該技術利用不同食用菌子實體或加工副產物，制作不同功效的食用菌系列 凍干方便菌湯，適用于食品加工企業、凍干食品加工企業、果蔬加工企業。解 決了生鮮果、菜、菌加工副產物綜合高效利用問題；將生鮮果、菜、菌的營養 與保健功效與糕點、面點相結合，改善和提高了普通糕點及面食制品的營養與 功能；增加了糕點及面食制品的花色品種，以滿足消費者的多樣化需求。該技 術可直接對生鮮果、菜、菌加工副產物進行濕法打漿利用，省去了脫水干燥與 粉碎工序，簡化了工藝流程，降低了加工能耗。通過打發順序的調整和有關配 料的應用，提高了制品的性能，保護了原料中的營養與功效成分。

本實用新型涉及一種乳酸菌復合菌劑的制備裝置，包括外箱體，外箱體頂部設置有蒸汽接口，外箱體內上部設置有上端開口的原料箱，原料箱通過管道連接有位于其下方的混合箱，混合箱兩端均通過轉軸轉動固定在固定板上，混合箱底部設置有凸輪，凸輪連接有位于外箱體外的驅動裝置，混合箱通過管道連接有菌種箱和培養箱，菌種箱通過管道與培養箱相連，菌種箱連接有伸出外箱體外的接種管，培養箱底部設置有加熱裝置，加熱裝置與控制器相連；本實用新型通過將原料箱、混合箱、菌種箱和培養箱均設置在外箱體內，方便進行蒸汽滅菌消毒，保證培養過程中的無菌無氧環境，凸輪驅動混合箱搖晃，避免傳統攪拌葉污染培養液的隱患。

本項目涉及功能性醋酸菌/乳酸菌及其發酵調控技術，可用于果蔬飲品、酵素、新型調味品的發酵制造。水果、蔬菜等農產品由于其保質期短，運輸成本高，較適宜于在原產地或產地附近進行深加工，以延長保質期及產品附加值。發酵類果蔬飲品由于經過微生物處理，在口味、質地以及營養成分等方面均得到了顯著改善，其中果蔬類益生菌類發酵飲品，更是得到關注健康的消費人群的青睞。然而目前市場中的發酵果蔬汁類產品，魚龍混雜，很多產品存在發酵程度不高；高度依賴后調配；微生物混亂及發酵過程控制不科學；食品安全性不能得到保障等問題。 針對這一類型的產品，本項目從發酵菌種、發酵工藝、功能成分分析以及產品標準化等方面系統的進行了研發。 1）豐富的菌種：本課題組擁有近百株背景明確、安全可靠、發酵性能優良 的微生物，形成了完備的釀造用菌種庫，包括乳酸菌、醋酸菌、酵母菌、米曲霉等。可以針對不同的發酵原料以及最終產品口感及質構的要求，選擇一種益生菌或復合發酵菌種，實現個性化的定制需求。 2）科學工藝：通過科學的發酵工藝及過程控制，實現了乳酸菌等微生物的高密度培養，活菌數可達 100 億/ml。大幅降低生產成本和周期，混菌發酵可由幾個月縮短至 10 天內，乳酸菌發酵縮短至 24 小時內。實現高效的物質轉化，總酸可以達到 6%，提高產品品質及生產穩定性。 3）成分分析：建立了完備的發酵產品成分分析技術平臺。針對與產品風味、以及腸道調節、增強免疫等健康功能緊密相關的有機酸、短鏈脂肪酸、多酚、多肽等功能成分進行精確定量分析以及健康功能評價。 4）產品風味: 本課題組研發的果蔬發酵產品口味濃郁、發酵特色明顯，無不良異味。避免了發酵后的過度調配及添加劑的使用，即可達到較優的感官要求。符合健康、綠色的現代加工食品的需求。 

農業生產中許多病害發生、發展嚴重，目前在生產中仍以化學防治為主，由于田間化學用藥次數的提高，病菌已產生明顯的抗藥性。如番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起的，是番茄生產中的主要病害，嚴重影響番茄的產量及品質。由于缺乏抗灰霉病的抗原材料，通過常規方法很難育成番茄灰霉病的抗性品種。傳統的化學防治不僅高殘留、高污染，且對葉圍有益微生物區系造成破壞，自然抗病能力進一步減弱。隨著人們生活水平的提高，對番茄等果蔬產品的品質要求越來越高，綠色和有機食品逐漸成為消費市場的主流，市場潛力巨大。在食品安全、環境保護、農業可持續發展的時代潮流下，研發新型生物農藥逐步取代化學農藥已成為農業生產的重要目標，也是經濟和社會發展的必然趨勢。 利用生防微生物及其次生代謝產物是生物防治的重要手段，我國和世界上許多國家已有商品化微生物農藥產品。目前對于番茄灰霉病的微生物防治研究多數處于實驗室和溫室階段，田間應用的極少，多數菌劑在田間應用過程中防效不穩，這是制約微生物菌劑開發應用的一個瓶頸。此外，多數研究只是針對某一種病害，具有廣譜抗性的菌株很少。本實驗室在土壤中分離出一株新的粉紅粘帚菌（WY-1），初步研究表明，該菌對番茄灰霉病、葉霉病、枯萎病、黃萎病和綿疫病等病原菌均有抑制作用（已獲專利，專利號ZL2009 1 0072862.4）該菌株是可通過多種機制共同作用抑制數種植物病原菌的生防菌，能有效的防治番茄、辣椒等多種作物的灰霉病、葉霉病、枯萎病、黃萎病和綿疫病等，同時具有較好的促生作用，具有一菌多效的特點。其作用機制包括競爭、重寄生、溶菌、拮抗和誘導抗性等。由于該生物制劑是一種廣譜抗性的生防菌劑，對農業生產具有重要的社會意義。這種以防治番茄灰霉病為主的廣譜性生防菌劑，可以有效的控制保護地生產病害的發生，在滿足菜籃子需求的基礎上，更保證了有機蔬菜的安全生產。

葡萄糖二酸是一種重要的化合物，在醫療和工業中有著廣泛的應用。目前生產葡萄糖二酸的方法主要以化學法-葡萄糖化學氧化法為主，但該方法具有選擇性低、成本高、得率低、要高溫及產生大量氧化反應副產物不利于后續葡萄糖二酸的分離等局限性。目前生物法合成葡萄糖二酸主要是在大腸桿菌中進行的，但在大腸桿菌中異源合成葡萄糖二酸被許多因素限制。釀酒酵母因具有耐酸能力強、耐低溫、可低 pH 發酵、沒有噬菌體感染、適合大規模發酵、易分離和高抗逆性等特點，已被廣泛用于產有機酸的研究，因此釀酒酵母比大腸桿菌更適合葡萄糖二酸的生產并具有更高的工業應用價值。利用釀酒酵母合成葡糖二酸具有很好的應用前景。 創新要點 1) 以釀酒酵母 BY4741 為出發菌株，將擬南芥的肌醇加氧酶 MIOX4 和丁香假單胞菌的 UDH 基因在 delta 重復序位點高效表達，敲除轉錄抑制因子OPI1 獲得工程菌 Bga-3，該菌株在分批補料發酵條件下能夠產 6 g/L 的葡萄糖二酸，為目前報道的最高值； 2) 通過提高工程菌的轉運胞外肌醇的能力和工程菌自身合成肌醇的能力，解決提高葡萄糖二酸產量的關鍵問題； 3) 進一步協調肌醇用于細胞自身代謝活動和葡萄糖二酸合成之間的分配關系，并通過提高葡萄糖二酸合成途徑效率和發酵優化，提高肌醇利用率和葡萄糖二酸合成的產量。 

機體內無機元素的代謝紊亂是糖尿病發病原因之一，因為胰島素抵抗而形成大量的Ⅱ型糖尿病。研究證明，鉻和釩元素可以提高靶組織對胰島素的敏感性因此補鉻補釩是提高胰島素利用率，降低胰島素抵抗的有效途徑之一，同時可以緩解由于胰島素抵抗而引起的眾多糖尿病并發癥。以酵母菌為載體提供的有機鉻和有機釩，有利于人和動物體的吸收利用，減少應激性，而且在加工和儲存中更為穩定。因此是安全高效的鉻釩元素補充形式。本項目提供鉻釩酵母的生產和鉻釩酵母相關食品飲料的制造技術。

可以量產/n針對當前工業發展對脂肪酶的大量需求與脂肪酶實際表達水平較低的技術瓶頸，突破了脂肪酶超高效表達技術關鍵，建立了真菌脂肪酶高效表達技術平臺，構建的解酯耶氏酵母脂肪酶Lip2基因工程菌10L發酵，酶活力可達6,5000 U/ml以上，比國際報道的最高值提高4倍以上，具有極強的國際競爭力。產品可用于油脂水解、轉酯、食品加工、烘焙、生物柴油制備、飼料添加劑、再生紙脫墨等廣泛用途。建設其發酵生產線預計需要800-1000萬元，經濟效益可觀。解酯耶氏酵母脂肪酶Lip2可用于油脂水解、轉酯、食品加工、烘

成果與項目的背景及主要用途： 蚯蚓又稱地龍，是以土壤中的動植物碎屑為食，經常在地下鉆洞，把土壤翻 得疏松，使水分和肥料易于進入土壤而提高土壤的肥力，有利于植物的生長；據 測定，蚯蚓的蛋白質含量約占干重的 53.5%-65.1%，脂肪含量約為 4.4%-17.38%， 碳水化合物約為 11%-17.4%，灰分 7.8%-23%。蚯蚓體內還含有豐富的維生素 D （約占鮮體重的 0.04%-0.073%），以及鈣和磷（約占鮮體重的 0.24%-0.188%） 等礦物質元素，所以蚯蚓可以作為家禽的飼料，是雞鴨喜好的“肉類”食物；蚯蚓 體內含有地龍素，地龍解毒素，黃嘌呤，抗組織胺和維生素 B 等多種藥用成分， 可作為很好的藥用材料；此外，蚯蚓還在淡水釣魚中適應面廣，各種水域，魚類， 212天津大學科技成果選編 氣候都較適宜的釣餌。目前養殖蚯蚓，一般以牛糞，豬糞等動物糞便及稻草，沼 氣和生活垃圾等為飼料，但這些資源或者數量少或者難以收集。 近年來，隨著食用菌需求量的不斷增加，以農作物秸稈和棉籽殼為培養基料 栽培生產食用菌技術發展迅速，并逐步形成規模化和產業化。而栽培各種食用菌 類后剩下的底料-菌糠，數量也大增。據測定，收菌后的菌糠，粗纖維降解 50%， 木質素降解 20%，而粗蛋白含量由原來的 2%提高到 6%-7%，脂肪含量增加 1-5 倍，而且易于粉碎，氣味芳香，適口性好。此外，菌糠中還含有豐富的氨基酸， 多糖及鐵鈣鋅鎂等微量元素，以及一些代謝產物如微涼酚性物，少量生物堿，黃 酮，還含有肌酸多肽植物甾醇及三萜皂苷等化學物質。丟棄不僅浪費資源，而且 會造成環境污染。因此，菌糠是農業生產中很好的肥料原料，應充分加以利用。 技術原理與工藝流程簡介： 1 對菌糠的前處理：將食用菌的廢棄培養基菌糠粉碎，噴水攪拌，使其充分 濕潤，且均勻，裝入發酵罐內。 2 加入 40-50℃水使菌糠的含水量在 50%-60%，優選 55%，再用 80-85℃的 熱空氣滅菌 16-20 小時，優選 18 小時，降溫至 30-40℃。 3 加入至少含有 1*108 個菌/克的菌粉，所述菌粉加入質量為菌糠干重的 1.0%-2.5%，所述菌粉為乳酸菌、芽孢桿菌和粉狀畢赤酵母菌株至少一種。通入 30-40℃的空氣，通空氣量為 0.2-0.3L/min*kg 菌糠干重，通空氣 24-36 小時，然 后密閉發酵 10-15 天，得到發酵產物，將所述發酵產物移除發酵罐，晾曬 1-2 天。 4 用草木灰和石灰粉調節 pH 為 6.0-7.0，既制成一種菌糠混合發酵制備的蚯 蚓餌料。 5 采取室內養殖蚯蚓，將制備的蚯蚓餌料均勻鋪在 100*30*30cm 的木盆里， 厚度 10cm，鋪好后，撒上適量的水，餌料的濕度保持在 50%-70%之間。將蚯蚓 均勻撒上，每平方米投放蚯蚓 500g，溫度保持在 15-25℃。蚯蚓投放一天，觀察 無異常反應，19 天可擴群一倍。 應用前景分析及效益預測： 213天津大學科技成果選編 本項目克服了現有蚯蚓養殖培養料資源缺乏和菌糠污染環境的不足，采用菌 糠混合發酵制備蚯蚓餌料為菌糠的綜合利用及生產高附加值產品（蚯蚓）提供了 一條有效解決途徑。 技術水平及專利與獲獎情況： 已獲得相關授權專利 應用領域：蚯蚓養殖企業，食用菌生產企業