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丁二酸，又稱琥珀酸，是工業上一種重要的 C4 平臺化合物，廣泛應用于食品、醫藥、表面活性劑、清潔劑、綠色溶劑、生物可降解塑料等領域。微生物發酵方法將來自可再生生物質（如淀粉、纖維素）的還原糖轉化為丁二酸，減少化學品對石化原料的依賴，生產過程環境友好，且還能夠固定 CO2，緩解大氣中的溫室效應。本技術具有自主知識產權的厭氧發酵丁二酸生產菌株，以葡萄糖或多種非糧食原料如秸稈、玉米芯等為原料厭氧發酵丁二酸。 創新要點 選育得到自主知識產權的微生物菌種；以廉價的玉米、木薯、糖蜜、菊芋、秸稈、酒糟等為原料，厭氧發酵生產丁二酸, 以及棉纖床發酵工藝。 

1、成果來源、成果被評價及認定（發明專利授權號）等情況 本項目來源于國家“十二五”科技支撐計劃項目“大宗糧食綠色加工技術與 產品”中課題“玉米淀粉加工關鍵技術研究與示范（2012BAD34B07，479 萬元， 研究起止時間：2012.01-2014.12）”和國家自然科學基金“酶法選擇性合成單一 類型環糊精的控制策略研究（31101228，25 萬元，研究起止時間：2012.01- 2014.12）”，屬于農產品深加工科學技術領域。本項目累計申請發明專利 7 項（1 項獲授權），發表論文 11 篇（8 篇被 SCI 收錄），于 2015 年 7 月通過中國糧油學 會鑒定，獲國際先進評價。 2、主要技術內容、作用、對行業的意義，獲獎情況 CGT 酶生產環糊精最不利的條件之一是產物特異性差，給產物的分離純化 帶來很大不便。同時，CGT 酶存在的另一大缺陷是其熱穩定性較差，由于在環糊 精工業化生產中，底物淀粉首先要經過高溫糊化、液化處理，然后降溫至適當溫 度進行環化反應，若 CGT 酶能夠適應更高的反應溫度，勢必有助于提高反應效率， 因此，有必要改善 CGT 酶的熱穩定性，提高其催化效率，進而有效降低環糊精生20 產成本。本項目主要是通過改善 CGT 酶產物特異性和熱穩定性，提高該酶的使用 性能，將其應用于環糊精的工業化生產中，能顯著降低環糊精的生產成本，促進 環糊精在各個領域的廣泛應用。因此，隨著環糊精在食品、醫藥等領域中的應用 越來越廣闊，開發改善 CGT 酶使用性能的關鍵技術顯得尤為重要，具有很好的推 廣應用前景。 3、成果的技術指標、創新性與先進性 本項目在長期從事淀粉生物轉化研究的基礎上，針對環糊精工業化生產過程 中 CGT 酶的產物特異性和熱穩定性較差問題，通過深入研究和不懈努力，逐步改 善了 CGT 酶的產物特異性和熱穩定性，突破了關鍵技術，并實現了具有理想產物 特異性和熱穩定性的β-CGT 酶突變體在酶法生產β-環糊精中的應用。該酶使用 性能改善易操作，具有很好的應用價值，技術位于國際領先水平。與國內外同類 技術相比，具有以下創新： ①針對 CGT 酶產物特異性較差的問題，確定了 CGT 酶的產物特異性與其一級 結構的相關性，獲得構建具有理想產物特異性的 CGT 酶突變體的簡單可行方法， 為從本質上改善 CGT 酶的產物特異性提供理論基礎； ②針對 CGT 酶熱穩定性較差的問題，采用定點突變技術闡明了重要氨基酸殘 基對 CGT 酶熱穩定性產生影響的規律，獲得了構建具有理想熱穩定性的 CGT 酶突 變體的簡單可行方法，為從根本上改善 CGT 酶的熱穩定性打下了基礎； ③ CGT 酶使用性能的改善方法簡單易行，所得到具有理想產物特異性和熱 穩定性的酶突變體可直接應用于β-環糊精的工業化生產，能提高β-環糊精的得 率，降低β-環糊精的生產成本。 

環糊精在食品、香料、醫藥、農藥、化工等行業有著廣泛的應用。本項目通過基因工程技術構建了高效表達?-CGT 酶工程菌，通過發酵優化，發酵液酶活達到 100 U/ml (以?-環糊精的生成速率計)以上，70400 U/ml (以水解活性計)，具有發酵周期短，工藝簡單易控等特點。發酵結束后發酵液過濾除菌可以直接作為酶液進行轉化反應。此外，通過蛋白質工程技術改造了酶的產物特異性，當以15%淀粉為底物時，環糊精總轉化率達到 55%以上，其中α-環糊精含量達到 85％以上。

-酮戊二酸是一種重要的有機酸，在食品、醫藥、化工和化妝品等行業都有 廣泛應用。目前，工業上生產?-酮戊二酸主要采用化學法，由于化學法合成?-酮 戊二酸的過程中存在嚴重的安全問題，在食品和化妝品的應用中受到限制。而微 生物發酵法正以其獨特的優勢：高產量、低能耗、可持續發展、環境友好等受到 越來越多的關注。因此，微生物發酵法生產?-酮戊二酸在食品、化妝品和保健品 行業具有廣闊的應用前景。主要技術性能指標：在 5 M3 發酵罐中?-酮戊二酸的平均產量為 64.2 g/L，發酵周期平均為 154.7 hr，提取總收率平均為 89.1%。

己二酸是一種重要的有機二元羧酸，廣泛應用于有機合成、醫藥和潤滑劑制造等領域。目前，工業上己二酸的生產路線主要通過硝酸對環己醇—環己酮的混合物(KA 油)進行氧化制取。雖然己二酸的化學合成方法已經成熟，但是存在著工藝流程長、副產物較多、工業“三廢”排放嚴重、產品收率不高等問題，特別的其溫室氣體氮氧化物的排放量巨大。因此，研究開發新的清潔無害己二酸生產工藝越來越受到人們的重視。本成果提供了一種己二酸的全生物合成方法，可以利用可再生碳源，獲得高產量的己二酸，同時產品的回收提取更加方便簡單，極大程度地降低了對環境的污染程度。 創新要點 本項目在大腸桿菌中重構逆己二酸降解途徑，實現了己二酸的高效生物合成。通過對菌株進行代謝改造，選用組成型啟動子以避免高額誘導劑的使用，最終在 5 L 發酵罐中實現了己二酸的高產，同時大幅度降低生產成本，使工業化生產己二酸成為可能。

D-異抗壞血酸作為維生素 C 的光學異構體，具有抗氧化作用強、氧化速度慢等優點，廣泛應用于食品、醫藥、化工等工業領域。2-酮基-D-葡萄糖酸是 D-異抗壞血酸的前體。經篩選獲得一株以(NH4)2SO4 為唯一氮源的高產 2-酮基-D-葡萄糖酸菌株，在 30L 發酵罐中，發酵時間 42 h；產量達到 265.8 g/L，糖酸轉化142率為 1.04 g/g。在 500 L 發酵罐中，發酵 48 h，產量達到 220 g/L，糖酸轉化率 0.99 g/g。此生產菌株在發酵過程中無副產物生成，所得產品純度高。 

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目前使用的一次性聚合物材料如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等，在自然界中很難降解，已造成了嚴重的白色污染。因此，合成在自然環境中能夠降解的聚合物材料，已經成為當前研究的熱點之一。 聚丁二酸丁二醇酯（PBS）的熔點為113℃，性能介于聚乙烯、聚丙烯之間。目前高分子量PBS的制備主要采用直接縮聚法，需要很高的真空度（0.2mmHg以下），在工業化中存在較大困難，對設備要求高。本技術建立了一種縮聚-擴鏈法，先以丁二酸與丁二醇進行熔融縮聚，制備特性粘度在0.5以下的PBS預聚體，再經擴鏈，獲得特性粘度在0.7～1.0dL/g之間的PBS。這種方法原料配比較易控制，所需設備較為簡單，不需要太高的真空度，便于工業化推廣。技術指標PBS外觀：無色或淡黃色固體；特性粘度：0.7～1.0 dL/g；熔點：112～115℃。可用做生物降解地膜、食品包裝材料，汽水、可樂、洗發水瓶，以及紙質食品包裝盒的可降解涂層，可降解熱溶膠等。本技術所得的產品與日本Showa Highpolymer公司的BIONOLLE產品（PBS）相當，性能相近，且在擴鏈劑方面有創新。所得產品應用范圍廣泛，技術具有非常廣闊的應用和市場前景。 所需設備如下： 1、聚酯反應釜：能夠加熱至220℃，承受1mmHg的負壓； 2、真空系統：從常壓到1mmHg負壓可調； 3、直接造粒系統：能夠進行聚合物的熔融切片、造粒。 本技術具有顯顯著的經濟效益和社會效益。

【項目來源】南京中醫藥大學科技創新風險基金項目。項目編號：CX201101。【知識產權】已申請發明專利：一種從丹參水提醇沉物中制備水蘇糖的方法，專利申請號：201110122779.0。【類    別】保健食品。【劑 型】顆粒劑。【處方來源】有文獻報道，水蘇糖是一種多功能的低聚糖，被世界食品醫藥界譽為“健康寶貝”，它既可作為一種免疫調節、改善胃腸道功能的保健品直接服用，也可作為有益的食品輔料添加在食品或飲料中。【保健功能】免疫調節、改善胃腸道菌群功能。適應于免疫低下，胃腸道功能紊亂者，尤其適宜于老人及小孩。【主要技術指標】1、對丹參醇沉物廢料進行了糖類化學成分研究，并采用樹脂吸附、NH2-C18中壓柱層析，NMR、MS等技術，首次從中分離鑒定了一種含量較高的有益低聚糖成分—水蘇糖，為綜合利用丹參提供了科學依據。2、以大孔樹脂—陰陽離子交換混合樹脂聯用，可將丹參素及原兒茶醛等小分子酚酸及丹酚酸B等二聚體以上的酚酸類成分有效去除，達到精制丹參水蘇糖的目的。【推廣應用前景】本項目實現了丹參注射液制備過程中的廢物利用，為中藥材綜合利用提供了示范，有助于節省中藥資源，減少中藥生產對環境污染，如以每年使用500噸丹參藥材的生產企業計，其水提醇沉物可生產水蘇糖40-50噸，進一步開發成添加劑或保健食品，將產生可觀的經濟效益。【進展情況】1、完成了丹參醇沉物原料中水蘇糖成分的結構確證。2、完成了丹參精制水蘇糖的制備工藝。3、初步確定了丹參精制水蘇糖中水蘇糖純度>80%。4、已申請發明專利1項。

丁二酸又名琥珀酸，是生物煉制產品工程中最重要的碳四平臺化合物，是制備多種重要化工中間體（1，4-丁二醇、四氫呋喃、g-丁內酯等）與生物可降解材料（PBS）的原料，市場需求總量將有望由目前的1.8萬噸擴展至400萬噸。傳統生產方法采用的是從丁烷經順丁烯二酸酐通過電解生產，生產污染大，成本高，抑制了丁二酸這一大宗化學品的發展潛力。生物法生產丁二酸的主要原料來源廣泛且價格低廉（玉米、廢乳清、工農業生產廢料等），可以減少對不可再生資源的消耗，微生物合成丁二酸的過程中吸收并固定CO2用于菌株的代謝，并最終生成丁二酸，每生產1kg丁二酸，將會有0.37kg的CO2被固定。如果將發酵生產丁二酸與另一大宗發酵產品乙醇的生產過程進行耦合，更可將發酵生產乙醇產生的CO2加以利用，減少溫室氣體的排放，并同時生產出丁二酸、乙醇等產品。該制備技術具有產物濃度高、原料來源豐富、分離簡便、產品質量高等優勢。可利用葡萄糖、玉米粉糖化液、纖維素/半纖維素水解糖液并在發酵中固定二氧化碳氣體作為碳源，在較高葡萄糖濃度下（100g/L）實現了較高濃度產物的累積（60~70g/L），生產強度達1.5g/（L?h），丁二酸提取收率≥80%，產品純度≥98%。擁有具有自主知識產權的丁二酸生產菌株：產琥珀酸放線桿菌NJ113，該菌株具有良好的丁二酸生產性狀，生產水平目前處于國際先進、國內領先。建立了從種子培養、厭氧發酵、產物分離提取及檢測分析等一系列較為完整的上下游工藝，具有路線簡單、便于操作、綠色清潔等優點。