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研發階段/n一種豬藍耳病基因重組豬霍亂沙門氏菌疫苗及應用。　　成果簡介：沙門氏菌是一種胞內寄生的革蘭氏陰性腸道桿菌，具有侵襲性。減毒沙門氏菌為載體的基因工程疫苗具有無法比擬的優越性，口服該種基因工程疫苗可以在激發產生抗沙門氏菌免疫應答的同時誘發特異性針對外源蛋白的體液和細胞免疫。豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸道疾病的高度接觸傳染病，可對豬場造成巨大的損失。本發明涉及一種豬藍耳病基因重組豬霍亂沙門氏菌疫苗及應用，屬于動物細菌基因工程技術領域，具

01. 成果簡介 中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）是2012年在中東地區首先發現的一種新型冠狀病毒，與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）同屬于β冠狀病毒，能夠引發嚴重的人類呼吸系統疾病。據世界衛生組織的最新統計表明，MERS-CoV已造成全球27個國家2428例感染，致死率高達35%。 MERS-CoV表面刺突蛋白（Spike）蛋白是病毒顆粒與細胞受體二肽基肽酶4（DPP4）作用的關鍵蛋白，也是MERS-CoV疫苗與保護性單克隆抗體研究的熱門靶點。本項目團隊在靶向刺突蛋白的高活性中和抗體篩選、鑒定、分子結構研究中取得了一系列突破。本團隊在國際上首批報道了兩株人源MERS-CoV中和抗體MERS-4與MERS-27，它們均能高效抑制假病毒與活病毒對體外培養細胞的侵染，在動物模型中也顯示了很好的保護作用。該團隊還綜合運用結構生物學、生物化學以及病毒學研究方法闡明了這兩株抗體識別Spike受體結合結構域（RBD）的不同位點，并阻斷Spike與受體DPP4的結合。 本項目團隊還利用一種稀有黑猩猩腺病毒AdC68為載體，搭載MERS-CoV表面全長的Spike蛋白，在轉基因小鼠（hDPP4-KI）模型中，一次滴鼻免疫即可誘導產生長期保護性免疫反應，并完全預防小鼠感染或降低感染后的疾病進展速度。解決了目前研發的MERS-CoV疫苗大多需要進行多次免疫注射的復雜程序問題。進一步的抗體分析表明，免疫動物血清中含有廣譜高滴度針對RBD的多克隆和單克隆中和抗體，能夠有效阻斷病毒與受體DPP4的結合，從而解析了其長期保護性免疫反應的分子基礎和機制，為疫苗下一階段進入大動物模型和人體臨床試驗做好了準備。                        MERS-CoV及其相關中和抗體和疫苗研究時間軸AdC68-S重組疫苗在hDPP4-KI轉基因小鼠模型上的保護效果02. 應用前景 本項成果可應用于治療或預防中東呼吸綜合征冠狀病毒的抗體藥物及疫苗候選物。03. 知識產權 本項成果已申請4項發明專利，其中3項已授權。04. 團隊介紹 本項目團隊由生命學院實驗室與醫學院實驗室聯合組成，兩位實驗室負責人分別為清華大學生命學院和醫學院教授、博士生導師，主要研究方向分別為結構生物學與病毒學，已發表國內外高水平學術論文數十篇，聯合申請專利4項。05.合作方式 技術許可。06.聯系方式 郵箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn

隨著世界養豬業的發展，規模化飼養技術的應用和飼養高度密 集，以及突發腹瀉因素存在，使得豬腹瀉病日趨流行，危害日漸嚴重。豬傳染 性胃腸炎與流行性腹瀉在養豬場引起豬腹瀉病的報道屢見不鮮，特別是規模化 豬場在受到藍耳病、圓環病等感染之后免疫功能下降時，豬腹瀉類病伺機暴發， 導致較嚴重的經濟損失。本成果是利用自主分離鑒定豬傳染性胃腸炎與流行性 腹瀉病毒，通過基因工程的方法，在乳酸菌中進行表達，通過優化培養工藝， 提高乳酸菌的培養密度，混合研制的多價口服疫苗，用于該類疾病的免疫預防。 該產品的開發為該病的防控起到重要作用，具有重要的應用價值和經濟效益。 

腹瀉是導致仔豬死亡的頭號疾病，每年給我國生豬生產帶來巨大經濟損失。目前，導致仔豬高發病率和高死亡率的主要致病原是變異株豬流行性腹瀉病毒（vPEDV）和新現豬丁型冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）。然而，目前國內外尚無防控vPEDV和PDCoV感染致病的疫苗。 本科技成果是我校動科院預防獸醫學以唐玉新教授為首的科研團隊聚焦于豬腸道腹瀉病原研究，成功分離出穩定、高滴度的vPEDV和PDCoV為基礎成功研制而成。PDCoV是導致仔豬腹瀉的新現豬丁型冠狀病毒，該團隊在我國大陸本土首先發現并進行了系統研究，成果率先在國際SCI源刊物報道，該論文已成為ESI熱點論文（2015）和高被引論文（2016），實現了江西農業大學高被引論文零的突破（引自：基于ESI的江西農業大學優勢學科評估分析報告（第1期），圖書館信息簡報，2017年6月）。vPEDV+PDCoV疫苗創制工作，獲得“十三五”國家重點研發專項資助（2017YFD0500600），目前已經完成實驗室階段等工作，即將進入臨床試驗階段；成果目前已經轉讓給國內一家疫苗上市公司，轉讓金額1500萬元。本項目研究產品有望成為我國一類新獸藥，上市后，將產生巨大的經濟效益和社會效益，據估算，每年可減少仔豬死亡約1000萬頭，創造直接經濟效益>100億元，對提高生豬生產效益，降低動物病原對人類的威脅，保障人類健康和動物源食品安全，維持CPI穩定均可起到十分的重要作用。

國際頂級綜合期刊美國科學院院刊（PNAS）在線發表動物醫學院孔慶科博士課題組在多糖疫苗研究中的重要研究成果“Synthesis and delivery of Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides by recombinant attenuated Salmonella vaccines”（減毒沙門氏菌疫苗合成及遞送來源于肺炎鏈球菌的多糖抗原）。該研究首次通過合成生物學，細菌遺傳學及免疫學等方法，將革蘭氏陽性細菌的表面多糖抗原成功表達合成于革蘭氏陰性細菌減毒沙門氏菌的表面，并連接于沙門氏菌內毒素的類脂A上，利用遺傳改造及調控的減毒沙門菌疫苗載體遞送肺炎鏈球菌的多糖抗原開發新型疫苗。該方法突破了目前固有的陽性細菌多糖疫苗的構建方式，為將來快速、高效的構建多糖疫苗奠定了基礎。 博士后蘇華荔及青年教師劉青博士為共同第一作者，動物醫學院孔慶科博士為通訊作者，西南大學為第一完成單位及第一通訊作者單位。美國科學院院士、佛羅里達大學Curtiss教授為共同通訊作者，動物醫學院2017級碩士研究生卞曉萍及佛羅里達大學王世峰博士參與相關工作。該研究得到國家自然科學基金及美國NIH項目的資助。

已有樣品/n豬流行性腹瀉病毒重組豬霍亂沙門氏菌基因工程活疫苗及制備與應用。　　成果簡介：本發明的重組菌株表達的是豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的保護性抗原基因。其中S蛋白的A、D抗原位點和N蛋白的N321抗原位點是豬傳染性胃腸炎病毒重要的免疫原性基因片段，COE基因和SD基因是豬流行性腹瀉病毒重要的免疫原性基因片段，均具有良好的免疫保護性。可以同時提供針對豬霍亂沙門氏菌、傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒三種病原的保護力。　　應用前景：目前，PED商品化疫苗主要有滅活苗和弱毒苗兩種，這兩種疫苗

成果描述：目前已制定 《雞新城疫（La Sota）、傳染性支氣管炎（SAIBK）二聯滅活生產與檢驗用種毒的研究資料》、《雞新城疫（La Sota）、傳染性支氣管炎（SAIBK）二聯滅活疫苗制造與檢驗規程》、《雞新城疫（La Sota）、傳染性支氣管炎（SAIBK）二聯滅活疫苗質量標準》等相關技術標準，研制出雞新城疫（La Sota）、傳染性支氣管炎（SAIBK）二聯滅活疫苗，已進行申報臨床試驗。市場前景分析：疫苗投入生產和使用后，預計在全國市場占有率達到20%以上。與同類成果相比的優勢分析：該疫苗針對目前雞場流行腎型IBV毒株以及新城疫II型毒株，具有良好的免疫效果。疫苗投入生產和使用后，預計在全國市場占有率達到20%以上。

本產品含有雞新城疫病毒 La Sota 株和傳染性支氣管炎病毒 QXL87 株，每羽份病毒雞新城疫病毒含量不低于 106 EID50，雞傳染性支氣管炎病毒含量不低于 103.5 EID50；產品對雞新城疫免疫保護效率不低于 90%，對 QX 型傳染性支氣管炎病毒免疫保護效率不低于 80%。

本發明構建一種新型混合佐劑DDA/PolyI:C。該混合佐劑組 （AMM+DDA/PolyI:C）和單獨佐劑組（AMM/DDA）分別加強免疫小鼠兩 次后，脾臟淋巴細胞經抗原AMM刺激后，皆可產生分泌較僅有融合蛋 白AMM組高的IFN-γ; 肺部荷菌量試驗表明佐劑實驗組加強BCG免疫 后，肺部荷菌量都較PBS組低；肺組織病理分析顯示混合佐劑組 AMM+DDA/PolyI:C強化BCG免疫后，肺組織病理損傷較BCG組和DDA為佐 劑加強組輕（P＜0.05＝。

雞新城疫、禽流感、Ⅰ群禽腺病毒是影響養禽業發展的三種傳 染性疫病，這三種傳染性疫病在我國很多地區的養雞場同時存在，給養禽業造 成了極大的經濟損失。青島農業大學研發團隊一直致力于疫病的流行動態規律 及病毒變異情況跟蹤調查。通過長期流行病學調查、病毒分離鑒定及對各地流青島農業大學科技成果介紹 2017 －34－ 行毒株的保護效果等分析研究，最終篩選出與流行毒株同源性高、免疫原性好 且有自主知識產權的病毒毒株作為制苗用毒株。根據疫病流行情況開展了雞新 城疫、禽流感（H9 亞型）、禽腺病毒（Ⅰ群，4 型）三聯滅活疫苗的研究工作， 在完成了毒種、生產工藝、安全、效力、免疫期、保存期、中間試制等研究基 礎上獲得了詳實的試驗數據。該產品具有廣闊的市場應用前景。