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1、成果來源、成果被評價及認(rèn)定（發(fā)明專利授權(quán)號）等情況 本項目來源于國家“十二五”科技支撐計劃項目“大宗糧食綠色加工技術(shù)與 產(chǎn)品”中課題“玉米淀粉加工關(guān)鍵技術(shù)研究與示范（2012BAD34B07，479 萬元， 研究起止時間：2012.01-2014.12）”和國家自然科學(xué)基金“酶法選擇性合成單一 類型環(huán)糊精的控制策略研究（31101228，25 萬元，研究起止時間：2012.01- 2014.12）”，屬于農(nóng)產(chǎn)品深加工科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本項目累計申請發(fā)明專利 7 項（1 項獲授權(quán)），發(fā)表論文 11 篇（8 篇被 SCI 收錄），于 2015 年 7 月通過中國糧油學(xué) 會鑒定，獲國際先進評價。 2、主要技術(shù)內(nèi)容、作用、對行業(yè)的意義，獲獎情況 CGT 酶生產(chǎn)環(huán)糊精最不利的條件之一是產(chǎn)物特異性差，給產(chǎn)物的分離純化 帶來很大不便。同時，CGT 酶存在的另一大缺陷是其熱穩(wěn)定性較差，由于在環(huán)糊 精工業(yè)化生產(chǎn)中，底物淀粉首先要經(jīng)過高溫糊化、液化處理，然后降溫至適當(dāng)溫 度進行環(huán)化反應(yīng)，若 CGT 酶能夠適應(yīng)更高的反應(yīng)溫度，勢必有助于提高反應(yīng)效率， 因此，有必要改善 CGT 酶的熱穩(wěn)定性，提高其催化效率，進而有效降低環(huán)糊精生20 產(chǎn)成本。本項目主要是通過改善 CGT 酶產(chǎn)物特異性和熱穩(wěn)定性，提高該酶的使用 性能，將其應(yīng)用于環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)中，能顯著降低環(huán)糊精的生產(chǎn)成本，促進 環(huán)糊精在各個領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，隨著環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用 越來越廣闊，開發(fā)改善 CGT 酶使用性能的關(guān)鍵技術(shù)顯得尤為重要，具有很好的推 廣應(yīng)用前景。 3、成果的技術(shù)指標(biāo)、創(chuàng)新性與先進性 本項目在長期從事淀粉生物轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)上，針對環(huán)糊精工業(yè)化生產(chǎn)過程 中 CGT 酶的產(chǎn)物特異性和熱穩(wěn)定性較差問題，通過深入研究和不懈努力，逐步改 善了 CGT 酶的產(chǎn)物特異性和熱穩(wěn)定性，突破了關(guān)鍵技術(shù)，并實現(xiàn)了具有理想產(chǎn)物 特異性和熱穩(wěn)定性的β-CGT 酶突變體在酶法生產(chǎn)β-環(huán)糊精中的應(yīng)用。該酶使用 性能改善易操作，具有很好的應(yīng)用價值，技術(shù)位于國際領(lǐng)先水平。與國內(nèi)外同類 技術(shù)相比，具有以下創(chuàng)新： ①針對 CGT 酶產(chǎn)物特異性較差的問題，確定了 CGT 酶的產(chǎn)物特異性與其一級 結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，獲得構(gòu)建具有理想產(chǎn)物特異性的 CGT 酶突變體的簡單可行方法， 為從本質(zhì)上改善 CGT 酶的產(chǎn)物特異性提供理論基礎(chǔ)； ②針對 CGT 酶熱穩(wěn)定性較差的問題，采用定點突變技術(shù)闡明了重要氨基酸殘 基對 CGT 酶熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響的規(guī)律，獲得了構(gòu)建具有理想熱穩(wěn)定性的 CGT 酶突 變體的簡單可行方法，為從根本上改善 CGT 酶的熱穩(wěn)定性打下了基礎(chǔ)； ③ CGT 酶使用性能的改善方法簡單易行，所得到具有理想產(chǎn)物特異性和熱 穩(wěn)定性的酶突變體可直接應(yīng)用于β-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)，能提高β-環(huán)糊精的得 率，降低β-環(huán)糊精的生產(chǎn)成本。 

蛋白酶體是細(xì)胞用來調(diào)控特定蛋白質(zhì)的濃度和清除錯誤折疊蛋白質(zhì)的主要機制，是細(xì)胞中最普遍的不可或缺的大型 蛋白復(fù)合機器之一，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的蛋白降解機器。 蛋白酶體全酶是由蓋子 (Lid)和基座(Base)亞復(fù) 合體組成的調(diào)控顆粒RP(Regulatory Particle)所激活。基座亞復(fù)合體在組裝過程中最重要的一個步驟是異質(zhì)六 聚AAA-ATPase環(huán)的組裝。這個過程至少需要被PAAF1, p28/gankyrin, p27/PSMD9和S5b這四種調(diào)控顆粒(RP)組 裝伴侶蛋白分子所引導(dǎo)。天然的自由態(tài)19S調(diào)控復(fù)合體的構(gòu)象存在大量的亞穩(wěn)定態(tài)，并表現(xiàn)出大幅度的局部構(gòu)象漲 落，使冷凍電子顯微鏡技術(shù)成為解析其結(jié)構(gòu)的唯一手段。利用 冷凍電鏡解析人源蛋白酶體全酶的基礎(chǔ)上（見PNAS 2016, 113: 12991-12996），利用他們自主開發(fā)的基于統(tǒng)計 流行算法的高性能計算軟件ROME（見PLoS ONE 2017, 12:e0182130）與優(yōu)化的冷凍電鏡處理方法對p28-RP復(fù)合 體細(xì)微動態(tài)構(gòu)象進行深度分類，共解析出了1個4.5-? p28綁定的調(diào)控顆粒（RP）非AAA的亞復(fù)合體，3個近7-? p28 綁定的完整RP結(jié)構(gòu)，1個亞納米精度下的非p28綁定的完整RP結(jié)構(gòu)以及7個亞納米精度下的由Rpn1-p28-AAA組成的p28 綁定RP的亞復(fù)合體的動態(tài)構(gòu)象。觀察到自由態(tài)RP調(diào)控顆粒中p28-綁定的AAA環(huán)并沒有組成的閉 環(huán)孔狀通道，而是自發(fā)地在Rpt2-Rpt6和Rpt3-Rpt4界面上形成多個由“開”到“關(guān)”的拓?fù)渥儤?gòu)。

本項目涉及一種新型的超級糖胺聚糖裂解酶 HCLase. 通過對提取的外周血基因組 DNA 與目的基因 GSTM3 啟動子的甲基化特異 性引物對和探針、內(nèi)參基因 ALU-C4 的特異性引物對和 Taqman 熒光探針序列， 對處理過的 DNA 進行實時定量聚合酶鏈?zhǔn)剑≒CR）反應(yīng),用甲基化特異性 PCR 205 的方法檢測目的基因 GSTM3 和內(nèi)參基因 ALU-C4 的閾值循環(huán)值，并計算出基 因 GSTM3 甲基化定量值。有助于評估病情、判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療。

研發(fā)階段/n本成果合成了人工免疫原和包被原，制備出高效價的特異性抗體，建立了肌肉(豬、雞、魚)、肝臟(豬、雞)、腎臟(豬)中AOZ殘留檢測的ELISA方法，并與建立的多殘留檢測HPLC方法進行了對比。該方法的檢測限、回收率、變異系數(shù)均達(dá)到我國獸藥殘留快速檢測的要求。以上述方法為基礎(chǔ)，在國內(nèi)首次研制出動物樣品中AOZ殘留檢測ELISA試劑盒。通過與國外同類試劑盒、HPLC法的比對和動物殘留試驗證明，該試劑盒的靈敏度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性與國外試劑盒水平相當(dāng)。經(jīng)多家檢測機構(gòu)和研究單位的復(fù)核和應(yīng)用表明，該試劑盒

研發(fā)階段/n本發(fā)明公開了一種從高效表達(dá)的基因工程菌中提取重組黃曲霉尿酸氧化酶的方法。該菌是攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌Rosetta(DE3)，該重組質(zhì)粒是含黃曲霉尿酸氧化酶uricase基因的質(zhì)粒pET-30c(+)。用該菌生產(chǎn)黃曲霉尿酸氧化酶的方法包括四個步驟：A、工程菌發(fā)酵，累積胞內(nèi)尿酸氧化酶；B、超聲波破胞，離心收集上清液（含可溶性尿酸氧化酶）；C、依次進行離子交換層析、疏水層析及凝膠過濾層析，收集活性峰；D、將活性峰冷凍干燥，即得高純度的重組黃曲霉尿酸氧化酶。本發(fā)明的優(yōu)點：生產(chǎn)重組黃曲霉尿酸氧化

(R)-硫辛酸是一種能消除老化與致病的類似維他命的物質(zhì)，可以去除機體自由基，促進機 體利用葡萄糖合成維生素C，能有效去除黑色素，還可協(xié)助輔酶進行有利于機體免疫力的生理 代謝，是一種萬能抗氧化劑藥物，廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療心臟病、糖尿病及老年癡呆癥。而近 年來歐美國家開始將其應(yīng)用于食品、保健品及化妝品，應(yīng)用范圍的擴展為其市場增長提供了廣 闊的空間。目前 (R)-硫辛酸的生產(chǎn)主要是通過化學(xué)拆分法合成 (化學(xué)拆分法合成途徑) ，即先通 過化學(xué)法合成混旋硫辛酸，再利用苯乙胺作為拆分劑對其進行拆分，得到的右旋硫辛酸苯乙胺 鹽，經(jīng)鹽酸脫鹽得到 (R)-硫辛酸粗品，精制后即可得到合格的 (R)-硫辛酸。但由于該法工藝復(fù) 雜，需要多次結(jié)晶，成本高、理論得率僅為50%。 本技術(shù)利用酶法不對稱還原8-氯-6-羰基辛酸乙酯制備 (S)-8-氯-6-羥基辛酸乙酯，再結(jié)合化 學(xué)法合成 (R)-硫辛酸的工藝路線 (化學(xué)-酶法合成途徑) ，可使 (R)-硫辛酸的合成步驟由化學(xué)-拆 分法的9步縮減到化學(xué)-酶法的6步、產(chǎn)品收率提高40%、生產(chǎn)成本降低20%，而且也顯著地減少 了原料消耗和廢物排放，是典型的環(huán)境友好的綠色合成工藝。合成的最終產(chǎn)品 (R)-硫辛酸的光 學(xué)純度在99%以上，其產(chǎn)業(yè)化更具有經(jīng)濟效益、更符合綠色技術(shù)的要求 

氯吡格雷 (Clopidogrel) ，商品名波立維 (Plavix) ，是抑制血小板聚集的藥物。年銷售額超 過百億美元，是目前世界上排名第二位的重磅炸彈級藥物。 (R)-鄰氯扁桃酸甲酯是氯吡格雷原料藥合成的重要前體化合物，酶促鄰氯苯甲酰甲酸甲酯 不對稱還原是制備 (R)-鄰氯扁桃酸甲酯的重要方法，具有轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品光學(xué)純度好、環(huán)境污 染小等顯著優(yōu)點。 本項目我們通過廣泛篩選，獲得一個高立體選擇性的羰基還原酶，將其與葡萄糖脫氫酶共 克隆表達(dá)于大腸桿菌中，使用重組大腸桿菌整細(xì)胞在單水相體系中高效催化鄰氯苯甲酰甲酸甲 酯的不對稱還原，使用廉價的葡萄糖作為輔底物，反應(yīng)體系中無需額外添加價格昂貴的輔酶， 反應(yīng)體系簡便，原料成本低廉。底物濃度可高達(dá)600 g/L，完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物 (R)-鄰氯扁桃酸甲酯 的得率高于90%，光學(xué)純度高于99.9%。具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。

阿托伐他汀，又名立普妥，能夠降低血漿膽固醇和脂蛋白水平，是目前世界銷售排名首位 的重磅炸彈級藥物，年銷售額超過百億美元。 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯是阿伐他汀手性側(cè)鏈合成的重要前體化合物，酶促4-氯-乙酰乙酸 乙酯不對稱還原是制備 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重要方法，具有轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品光學(xué)純度 好、環(huán)境污染小等顯著優(yōu)點。 本項目我們通過廣泛篩選，獲得一個高立體選擇性的羰基還原酶ScCR，該酶可以在有機 /水兩相體系中高效催化4-氯-乙酰乙酸乙酯的不對稱還原，使用廉價的異丙醇作為輔底物， 無需額外添加輔酶再生用酶，反應(yīng)體系簡單。使用含該酶的大腸桿菌整細(xì)胞作為催化劑，底 物濃度可高達(dá)600 g/L，完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的得率達(dá)96%，光學(xué)純度高于 99%。具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。

近日，東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院、江蘇省富碳材料器件工程研究中心張袁健教授團隊（https://carbosensing.group）在Fe-N-C納米酶在催化抗壞血酸氧化反應(yīng)中的機制研究取得進展，相關(guān)成果以“Insights into Iron Leaching from an Ascorbate-Oxidase-like Fe-N-C Nanozyme and Oxygen Reduction Selectivity”為題在化學(xué)領(lǐng)域國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊Angew. Chem. Int. Ed.以VIP Paper形式在線發(fā)表。

中試階段/n該項目公開了一種能識別甲睪酮的特異性單克隆抗體,它是由保藏號為CCTCCNO:C201493的雜交瘤細(xì)胞株MT9C10所分泌的。本發(fā)明還公開了一種檢測甲睪酮的酶聯(lián)免疫方法和試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體可以識別甲睪酮，識別靈敏度高，特異性好，本發(fā)明的ELISA方法和試劑盒檢測靈敏度、準(zhǔn)確度高，精密度好。