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一、成果簡(jiǎn)介 該項(xiàng)目是利用蚯蚓蛋白酶解技術(shù),研制的氨基酸系列農(nóng)用生化制劑。該項(xiàng)成果整體居國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平,技術(shù)產(chǎn)品填補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白，其中蚯蚓氨基酸酶解、蚯蚓植酸酶和抗菌肽研究達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。 二、技術(shù)特點(diǎn)

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，手性氨基酸作為最重要的原料和中間體，市場(chǎng)規(guī)模也越來(lái)越大。本項(xiàng)目目前研發(fā)的手性氨基酸包含L-2-氨基丁酸、D-蘇氨酸、L-天冬酰胺、L-叔亮氨酸、L-色氨酸等。 創(chuàng)新點(diǎn)： 1）本項(xiàng)目采用一鍋化反應(yīng)，以廉價(jià)的L-蘇氨酸為原料，經(jīng)過工程菌催化合成2-氨基丁酸，反應(yīng)時(shí)間10-12 h，原料的轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上，2-氨基丁酸的產(chǎn)量達(dá)到100 g/L以上。 2）以消旋化蘇氨酸為原料，進(jìn)行酶法拆分制備D-蘇氨酸。底物添加量達(dá)到2.5 M,反應(yīng)10 h內(nèi)達(dá)到完全拆分，D-蘇氨酸ee值為99%。 3）以天冬氨酸為原料，采用工程菌催化反應(yīng)10-12 h，L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到了94.4 %，L-天冬酰胺產(chǎn)量可達(dá)120 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到12.4 g/(L•h)。 4）基于構(gòu)建的基因工程菌，采用偶聯(lián)輔酶再生技術(shù)，轉(zhuǎn)化廉價(jià)底物合成L-叔亮氨酸，反應(yīng)24 h，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)95%，產(chǎn)量達(dá)到100 g/L以上水平。 5）其它手性氨基酸（L-色氨酸、D-氨基酸）發(fā)酵和生物合成正在陸續(xù)開展中。 6）多種高效酶制劑的工程菌株構(gòu)建、發(fā)酵產(chǎn)酶以及多種中間體的制備。如蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶、甲酸脫氫酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶等，以及利用這些酶制備的多種醫(yī)藥中間體。

自1984年首個(gè)重組胰島素獲得批準(zhǔn)以來(lái)，重組蛋白質(zhì)藥物因其高特異性及高活性逐漸受到人們的青睞；近5年來(lái)蛋白質(zhì)藥物批準(zhǔn)的量已經(jīng)隱隱趕超傳統(tǒng)小分子藥物。然而蛋白質(zhì)藥物往往藥代動(dòng)力學(xué)較差，循環(huán)時(shí)間短，需要高頻次重復(fù)用藥，給患者帶來(lái)極大的生活不便及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。另一個(gè)更為嚴(yán)重的問題是蛋白藥物的高免疫源性。以各類重組抗體為例，即使完全人源化的抗體在多次注射后也會(huì)產(chǎn)生大量的抗藥物抗體（anti-drug antibody，簡(jiǎn)稱ADA）；而ADA的產(chǎn)生輕則造成藥物失去本身的藥效，重則造成嚴(yán)重的過敏反應(yīng)甚至威脅病人生命安全。因此，如何避免臨床用藥過程中（尤其是多頻次給藥過程中）ADA的產(chǎn)生成為蛋白質(zhì)藥物研發(fā)的必要前提。蛋白質(zhì)PEG化不僅能夠延長(zhǎng)蛋白質(zhì)循環(huán)時(shí)間，也能通過其自身的位阻效應(yīng)一定程度上降低蛋白質(zhì)的免疫源性。然而PEG本身會(huì)誘發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生anti-PEG抗體（本質(zhì)上也是一種ADA），進(jìn)而導(dǎo)致其加速血液清除（簡(jiǎn)稱ABC效應(yīng)）。綜上所述，尋找新的低免疫源性聚合物用于蛋白質(zhì)修飾以同時(shí)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)與抑制ADA產(chǎn)生迫在眉睫。 聚氨基酸（也稱合成聚多肽）是一種模擬蛋白質(zhì)多肽結(jié)構(gòu)的合成高分子，可生物降解，生物毒性低，是理想的蛋白質(zhì)藥物修飾高分子。

海因是重要的手性合成前體，在全面分析了解反應(yīng)機(jī)理和氣液傳質(zhì)過程基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了新型的反應(yīng)體系，常壓條件高收率制備了海因，海因的摩爾收率（對(duì)羥基乙腈）為86.2%，高于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的高壓法收率（83%），且產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)良。開發(fā)了基于海因平臺(tái)的手性天然氨基酸和非天然氨基酸制備平臺(tái)技術(shù)。其中苯丙酮酸酶法制備L-苯丙氨酸的生產(chǎn)工藝，通過膜分離和模擬移動(dòng)床分離技術(shù)應(yīng)用，提高了產(chǎn)品收率和質(zhì)量。采用物料循環(huán)技術(shù)，減少了污染，大幅度降低了生產(chǎn)成本。同時(shí)還開發(fā)了L-色氨酸、L-酪氨酸、L-取代苯丙氨酸的酶法制備技術(shù)，均取得了較大的突破。在國(guó)內(nèi)首次開發(fā)了以芐基海因?yàn)榍绑w、規(guī)模生產(chǎn)D-苯丙氨酸的酶法制備工藝，提出D-海因酶催化機(jī)理模型，指出D-海因酶的立體選擇性是由于酶的巰水性“口袋”的結(jié)構(gòu)決定的，并合理解釋了酶催化過程。在理論和實(shí)踐的基礎(chǔ)上，采用該化學(xué)酶法工藝生產(chǎn)了六種光學(xué)純的D型氨基酸：D-苯丙氨酸、D-色氨酸、D-丙氨酸、D-纈氨酸和D-蛋氨酸，其中D-苯丙氨酸已成功實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)、D-色氨酸完成了中試。

氨基酸表面活性劑具有溫和及低刺激性，是一類綠色表面活性劑，本研究采用新的工藝技術(shù)，降低了產(chǎn)品成本。

成果描述：市售氨基酸類產(chǎn)品較為單一，少見復(fù)配產(chǎn)品。并且靈芝一直以來(lái)作為保健佳品，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)、降血糖、保肝、抗衰老、抗炎鎮(zhèn)痛等多種功效。現(xiàn)市場(chǎng)中靈芝類保健產(chǎn)品多以膠囊、粉劑為主。本品以氨基酸和靈芝配伍，劑型為口服液，具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用且利于吸收。市場(chǎng)前景分析：產(chǎn)業(yè)化，目前已經(jīng)成功轉(zhuǎn)讓一家企業(yè)，取得國(guó)家保健食品字號(hào)。保健食品市場(chǎng)。與同類成果相比的優(yōu)勢(shì)分析：所用原料符合中國(guó)衛(wèi)生部關(guān)于保健食品的原料要求，產(chǎn)品的衛(wèi)生指標(biāo)、理化指標(biāo)、功效成分指標(biāo)和安全性指標(biāo)等均符合衛(wèi)生部關(guān)于保健食品的相關(guān)要求。

手性氨基酸作為最重要的原料和中間體，市場(chǎng)規(guī)模也越來(lái)越大。本項(xiàng)目研發(fā)的手性氨基酸包含 L-2-氨基丁酸、D-蘇氨酸、L-天冬酰胺、L-叔亮氨酸、L-色氨酸等。2-氨基丁酸是一種非天然的氨基酸，是一種重要的化工原料，被用作為多種手性藥物合成中的重要中間體，包括抗結(jié)核藥物乙胺丁醇、布瓦西坦和抗癲癇 藥物左乙拉西坦。D-蘇氨酸是天然氨基酸 L-蘇氨酸的光學(xué)異構(gòu)體，是一種非天然氨基酸。主要應(yīng)用于手性藥物、手性添加劑和手性助劑等領(lǐng)域，在制藥行業(yè)作為手性合成的手性源，主要用于生產(chǎn)新型光譜抗生素、D-蘇氨醇和多肽合成過程的蘇氨酸保護(hù)劑。L-天冬酰胺是常見的 20 種氨基酸之一，在食品、醫(yī)藥、化工合成、微生物培養(yǎng)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。L-天冬酰胺可以作為添加劑用于清涼飲料,同時(shí)在腫瘤治療及蛋白質(zhì)糖基化中扮演重要角色。L-天冬酰胺常用于氨基酸輸液，以及具有降壓、平喘、抗消化性潰瘍、胃功能障礙等功能，并可用于治療心肌梗死、心肌代謝障礙、心力衰竭、心臟傳導(dǎo)阻滯、疲勞癥等。此外，L-天冬酰胺也是微生物培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)重要的添加劑。L-叔亮氨酸是一種非蛋白原的手性氨基酸, 由于叔丁基的空間位阻大, 叔亮氨酸的衍生物可在不對(duì)稱合成中作為誘導(dǎo)不對(duì)稱的模板。隨著不對(duì)稱合成的發(fā)展, 叔亮氨酸的應(yīng)用也非常廣泛。又由于占空間大的叔丁基鏈及其疏水性, 它在多肽的合成中能夠很好地控制分子構(gòu)象, 增加多肽的疏水性和受酶降解的穩(wěn)定性, 因此在藥物和生物應(yīng)用中正迅速地發(fā)展, 用于抗癌、抗艾滋病等藥物和生物抑制劑及肽等。

全球氨基酸市場(chǎng)需求增長(zhǎng)勢(shì)頭強(qiáng)勁，年均增長(zhǎng)5.6%以上。2017年，全球年產(chǎn)量已達(dá)850萬(wàn)噸，總銷售額超百億美元。目前，氨基酸的生產(chǎn)主要有三種方法，包括微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和酶法水解法等。其中，微生物發(fā)酵法因其產(chǎn)能高、成本低等優(yōu)勢(shì)，作為最主要的方法，生產(chǎn)了全球總產(chǎn)量85%以上的氨基酸。為應(yīng)對(duì)不斷升級(jí)的市場(chǎng)需求，氨基酸發(fā)酵企業(yè)亟需提高發(fā)酵產(chǎn)量和拓展氨基酸品種，而關(guān)鍵在于獲得氨基酸高產(chǎn)菌株。現(xiàn)有的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選方法如氨基酸類似物篩選法，存在毒性高、陽(yáng)性率低及種類受限等問題，無(wú)法滿足篩選需求。因此，開發(fā)全新的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選方法具有十分重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。 項(xiàng)目組通過增加序列中稀有密碼子的數(shù)量來(lái)提高蛋白翻譯所需氨基酸濃度的“門檻值”，利用必需基因和顏色蛋白編碼基因，建立了氨基酸高產(chǎn)菌株的選擇和篩選體系，并證明了該方法在大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中的可行性。本研究為氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選提供了新系統(tǒng)，理論上可用于任何一種天然氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選，同時(shí)也為氨基酸高產(chǎn)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)提供了新思路，可用于氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中優(yōu)良菌株的構(gòu)建，進(jìn)而推動(dòng)氨基酸市場(chǎng)的增長(zhǎng)，促進(jìn)氨基酸在飼料、食品、醫(yī)藥等民生領(lǐng)域的應(yīng)用。 目前，微生物細(xì)胞工廠的遺傳改造已經(jīng)基本完成，正在進(jìn)一步的改造。發(fā)酵生產(chǎn)的濃度、產(chǎn)率和速率都達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。進(jìn)一步的提高正在研究進(jìn)行中。

全球氨基酸市場(chǎng)需求增長(zhǎng)勢(shì)頭強(qiáng)勁，年均增長(zhǎng)5.6%以上。2017年，全球年產(chǎn)量已達(dá)850萬(wàn)噸，總銷售額超百億美元。目前，氨基酸的生產(chǎn)主要有三種方法，包括微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和酶法水解法等。其中，微生物發(fā)酵法因其產(chǎn)能高、成本低等優(yōu)勢(shì)，作為最主要的方法，生產(chǎn)了全球總產(chǎn)量85%以上的氨基酸。為應(yīng)對(duì)不斷升級(jí)的市場(chǎng)需求，氨基酸發(fā)酵企業(yè)亟需提高發(fā)酵產(chǎn)量和拓展氨基酸品種，而關(guān)鍵在于獲得氨基酸高產(chǎn)菌株。現(xiàn)有的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選方法如氨基酸類似物篩選法，存在毒性高、陽(yáng)性率低及種類受限等問題，無(wú)法滿足篩選需求。因此，開發(fā)全新的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選方法具有十分重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。 項(xiàng)目組通過增加序列中稀有密碼子的數(shù)量來(lái)提高蛋白翻譯所需氨基酸濃度的“門檻值”，利用必需基因和顏色蛋白編碼基因，建立了氨基酸高產(chǎn)菌株的選擇和篩選體系，并證明了該方法在大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中的可行性。本研究為氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選提供了新系統(tǒng)，理論上可用于任何一種天然氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選，同時(shí)也為氨基酸高產(chǎn)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)提供了新思路，可用于氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中優(yōu)良菌株的構(gòu)建，進(jìn)而推動(dòng)氨基酸市場(chǎng)的增長(zhǎng)，促進(jìn)氨基酸在飼料、食品、醫(yī)藥等民生領(lǐng)域的應(yīng)用。 目前，微生物細(xì)胞工廠的遺傳改造已經(jīng)基本完成，正在進(jìn)一步的改造。發(fā)酵生產(chǎn)的濃度、產(chǎn)率和速率都達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。進(jìn)一步的提高正在研究進(jìn)行中。

本發(fā)明提供一種氨基酸葉面肥料，由20％—50％復(fù)合氨基酸、1％—50％尼克酰胺、10％—20％七水硫酸亞鐵、10％—20％尿素、5％—10％硼酸、1％—5％抗壞血酸、1％—5％表面活性劑聚山梨酯80的物料組成，要求pH 5.0-6.0。本發(fā)明提供的氨基酸葉面肥料肥效穩(wěn)定，能顯著強(qiáng)化不同基因型水稻籽粒鐵營(yíng)養(yǎng)，平均能使精米中鐵含量顯著提升15％以上，顯著提升精米蛋白質(zhì)和氨基酸含量，可全面提升稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉，可在高效生物強(qiáng)化水稻籽粒鐵營(yíng)養(yǎng)，并顯著提升稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)中應(yīng)用。