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項目成果/簡介:在中國癌癥發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)增長趨勢，癌癥的治療效果不令人滿意。腫瘤靶向藥物是癌癥治療的新希望，具有方便、見效快的特點，在臨床已表現(xiàn)出較大的優(yōu)勢，能顯著改善患者的生存質(zhì)量和延長患者的生存期，是癌癥治療的首先藥物，但靶向藥物的應(yīng)用面臨兩個主要問題，一是靶向藥物的適用性問題，其治療效果與患者的基因突變類型密切相關(guān)，需要通過腫瘤患者的基因突變檢測來篩選適用患者；二是靶向藥物的耐藥問題，一般靶向藥物使用幾個月即可出現(xiàn)耐藥，可能產(chǎn)生新的耐藥基因。因此盲目使用靶向藥物，可能只對少數(shù)患者有效，治療效果很差，而如果采用基因突變檢測來指導(dǎo)靶向藥物的個性化治療，并且在治療過程中通過對耐藥基因的檢測了解靶向藥物的療效變化進(jìn)一步指導(dǎo)靶向用藥，則患者的治療效果可明顯改善，同時可避免無效用藥，節(jié)約社會成本。顯然采用靶向藥物的個性化治療方案可使患者受益最多，但受現(xiàn)有技術(shù)檢測靈敏度和特異性的限制該方案目前還難以實現(xiàn)。由于目前的基因突變檢測靈敏度和特異性不夠高，大都以腫瘤組織為檢測標(biāo)本，但很多晚期癌癥病人不適合手術(shù)治療無法獲取組織樣本，而細(xì)針穿刺等方法取樣較痛苦，患者往往難以接受，另外，對于手術(shù)患者腫瘤組織樣本難以再次取樣獲得，因此治療監(jiān)測過程中會出現(xiàn)無樣可取的情況；同時由于檢測靈敏度和特異性不夠高，現(xiàn)有技術(shù)只能進(jìn)行單一突變檢測，不能同時檢測多種點突變，由于突變種類較多，臨床檢測操作繁瑣，工作量較大。本項目針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的缺點進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新，采用特殊的TB-ARMS基因突變檢測技術(shù)使基因突變檢測靈敏度和特異性較現(xiàn)有技術(shù)提高十倍以上，從而可以血液樣品為檢測對象，并且可同時檢測多種點突變，簡化了操作流程，節(jié)約了成本。 本項目的目的是開發(fā)可以血液和組織樣品為檢測對象的高靈敏度和特異性的基因突變檢測試劑盒，用于臨床指導(dǎo)靶向藥物的個性化用藥，并將其推廣應(yīng)用。應(yīng)用范圍:與目前存在的基因突變檢測技術(shù)相比，本項目所采用的檢測技術(shù)具有更廣泛的適用性。本項目所采用的技術(shù)以病人血液為主要檢測標(biāo)本，可適用于所有肺癌和結(jié)直腸癌病人。由于具有高度的靈敏度和特異性，可在高野生型基因背景下進(jìn)行檢測，解除了傳統(tǒng)檢測技術(shù)對病人標(biāo)本的限制。血液標(biāo)本采樣簡單方便，與手術(shù)穿刺相比，極大的減輕了病人痛苦，也降低了取樣的成本，更容易得到病人的配合。對于繼發(fā)性耐藥的病人而言，使動態(tài)實時檢測耐藥基因稱為可能。項目階段:試驗階段效益分析:與目前存在的基因突變檢測技術(shù)相比，本項目研究采用的基因突變檢測技術(shù)具有更高的靈敏度和特異性，靈敏度可達(dá)到0.1％，即可在大于103個野生型基因的背景下檢測到一個突變基因。本項目研究已在基因突變檢測方面積累了一定經(jīng)驗，已完成了對EGFR和K-ras基因檢測的實驗室研發(fā)工作，前期的研究結(jié)果顯示，采用本項目的技術(shù)方法檢測EGFR 29種常見突變和K-ras基因8種常見的突變至少可達(dá)到0.1%的檢測選擇性，具有高度的靈敏度和特異性，并且可在同一反應(yīng)中同時檢測8種類型K-ras點突變，這是目前其他ARMS技術(shù)所無法達(dá)到的。并且采用本項目技術(shù)，我們進(jìn)一步研發(fā)了針對肺癌和結(jié)直腸癌靶向治療的EGFR C797S、braf、PIK3CA等突變檢測的試劑盒，其中EGFR C797S突變檢測試劑盒目前尚無上市產(chǎn)品，C797S為靶向藥物治療過程中產(chǎn)生的突變，可用于靶向藥物的耐藥監(jiān)測，以便及時指導(dǎo)病人改變治療方案。

產(chǎn)品種類：營養(yǎng)體細(xì)胞DNA單獨提取試劑盒、營養(yǎng)體細(xì)胞及芽胞DNA共同提取試劑盒、營養(yǎng)體細(xì)胞及芽胞DNA分別提取試劑盒三個系列。 產(chǎn)品用途：人及動物體糞便中細(xì)菌及芽胞DNA的提取與分離。 產(chǎn)品特點：不需要使用有毒的苯酚等試劑、快速，簡捷，整個細(xì)菌樣品操作過程可在1個小時內(nèi)完成、結(jié)果穩(wěn)定，產(chǎn)量高。OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，長度可達(dá)50kb～150kb，可直接用于PCR，Southern-blot，文庫構(gòu)建和各種酶切反應(yīng)。共同開發(fā)單位：江蘇師范大學(xué)江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室、無錫靈特生物技術(shù)有限公司。

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，在女性人群中HPV的感染率在13.5%左右。分子診斷是指應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)。免疫診斷（immunodiagnosis）是應(yīng)用免疫學(xué)的理論、技術(shù)和方法診斷各種疾病和測定免疫狀態(tài)。但現(xiàn)有單克隆抗體均無法達(dá)到HPV亞型鑒別目的，若干亞型特異性抗體均與其它亞型有交叉反應(yīng)。迄今為止市場上沒有高危型HPV免疫診斷試劑盒。因此我們開發(fā)的HPV免疫診斷試劑盒有望成為第一個高危HPV免疫檢測試劑盒。

項目研發(fā)背景及意義 根據(jù)中國人口協(xié)會、國家衛(wèi)健委發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，中國育齡夫婦的不孕不育率近年來已高達(dá)12%-15%，患者人數(shù)超過5000萬。其中，女性因素占比50%，男性因素占比40%，夫婦雙方共同原因占比10%。隨著環(huán)境污染、生育年齡推遲、生活壓力等原因，不孕不育夫婦數(shù)量還在不斷增加。 受中國傳統(tǒng)觀念影響，現(xiàn)階段不孕不育檢查主要以女性檢測為主，男性檢測指標(biāo)只有精液常規(guī)等基本指標(biāo)。但研究表明，在男性不育人群中，仍有15%的患者精液常規(guī)檢測結(jié)果正常。精液常規(guī)分析僅能反映48%男性的生育能力，并不能很好地預(yù)測精子的受精能力和妊娠結(jié)局，因此臨床迫切需要引入一些新的檢測指標(biāo)來正確評估精子功能，更準(zhǔn)確得預(yù)測精子的受精能力和妊娠結(jié)局。 已有的研究結(jié)果表明，精子受精過程中最為重要的三個功能指標(biāo)能更加全面地反映男性生育力，包括：精子持續(xù)運動潛能（線粒體功能）、精子穿過透明帶的能力（頂體功能）和受精后胚胎發(fā)育潛能（精子DNA碎片）： 1.精子線粒體為精子運動提供能量，線粒體功能異常會直接導(dǎo)致精子持續(xù)運動能力下降，進(jìn)而影響精子穿越子宮、到達(dá)輸卵管與卵子結(jié)合； 2.精子頂體協(xié)助精子穿過透明帶，頂體功能的正常與否直接決定精子的授精能力； 3.精子提供了一半的遺傳物質(zhì)（DNA），其完整與否可影響到受精卵原核的形成、受精卵卵裂能力、早期胚胎著床能力、后續(xù)胚胎的正常發(fā)育潛力及子代的健康。 上述指標(biāo)異常，臨床上可導(dǎo)致不育、反復(fù)流產(chǎn)和助孕治療成功率低等病癥。除此之外，近年來也出現(xiàn)了一些新的精液質(zhì)量評價指標(biāo)，成為關(guān)注的熱點，包括：精子活性氧水平、精子質(zhì)膜完整性： 1.精子細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平對精子核DNA的完整性、精子線粒體功能等均有影響，間接影響著精子細(xì)胞的損傷程度、精液質(zhì)量、受精能力以及男性生育力； 2.精子質(zhì)膜的完整性可以很好地反映精子的存活率，活精子是完成受精過程的前提。 上述指標(biāo)異常，是導(dǎo)致精液質(zhì)量下降、男性生育力降低的重要原因。因此，精液檢測指標(biāo)的增加有助于臨床更全面地評價男性精液質(zhì)量、預(yù)測男性生育力，并提出適合的治療方案或輔助生殖方案。   項目內(nèi)容與創(chuàng)新性 在復(fù)旦大學(xué)云鋒基金的支持下，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院呂旭楠與青島復(fù)諾生物醫(yī)療有限公司合作研發(fā)了精子DNA碎片、精子誘發(fā)頂體反應(yīng)、精子線粒體膜電位、精子活性氧類物質(zhì)（包括過氧化物和超氧化物）、精子質(zhì)膜通透性等一系列用于檢測男性生育力評價新指標(biāo)的體外診斷試劑，基于流式細(xì)胞術(shù)的檢測方法，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)，實現(xiàn)了臨床應(yīng)用所需的穩(wěn)定性、便捷性、準(zhǔn)確性和高效性。 本項目在整體實施過程中實現(xiàn)了以下創(chuàng)新： ① 計算機(jī)學(xué)科創(chuàng)新。本項目實現(xiàn)了三指標(biāo)均能匹配專用的數(shù)據(jù)分析軟件，經(jīng)過近千例大樣本量的算法設(shè)計和AI自我學(xué)習(xí)校準(zhǔn)，實現(xiàn)了一鍵化結(jié)果分析和報告管理。不再依賴傳統(tǒng)的肉眼辨別和手動框圖計算，減少了人為誤差，提升了結(jié)果的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。本項目軟件均已取得軟件著作權(quán)證書，結(jié)果圖示展示如下： ② 生物技術(shù)學(xué)科創(chuàng)新。本項目優(yōu)化了染料選擇和分組設(shè)計，其中頂體指標(biāo)采用獨特的雙染法設(shè)計，規(guī)避了過去需要新鮮樣本、且樣本需要優(yōu)選的冗雜過程，更符合臨床和實驗室開展的實際需求。本項目方法的創(chuàng)新使得原本單項目的檢測時間從3小時縮短至15分鐘，三項指標(biāo)聯(lián)檢時間20分鐘，其中手工操作僅需5分鐘，在國際上處于領(lǐng)先水平。這一突破從根本上解決了實驗室因原技術(shù)手段耗時長、費人工、操作復(fù)雜而難以開展的技術(shù)問題，造成臨床報告周期長、受檢者取報告不便的難題。該項技術(shù)創(chuàng)新目前獲得發(fā)明專利授權(quán)。 ③ 生物技術(shù)學(xué)科創(chuàng)新。本項目完全采用流式細(xì)胞儀的方法進(jìn)行檢測，替代了傳統(tǒng)的熒光顯微鏡法，單樣本檢測覆蓋的細(xì)胞數(shù)量多（約5000個），降低了系統(tǒng)誤差，提高了準(zhǔn)確度，提高了自動化程度和可重復(fù)性。   項目進(jìn)展與取得成效 本項目目前已完成科研轉(zhuǎn)化，取得醫(yī)療器械監(jiān)督管理部門的審批，獲得生產(chǎn)許可，具備臨床合規(guī)銷售的資格。市場推廣方面，除選擇原有的醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心作為合作伙伴外，還發(fā)起了與精子庫的聯(lián)合研究。現(xiàn)階段，本項目已取得以下成績： 1.臨床方面：目前，本項目已在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院、南京鼓樓醫(yī)院等多家三級及以上醫(yī)院開展合作。 2.精子庫方面：本項目單位已與國家衛(wèi)健委出生缺陷與生殖健康重點實驗室建成生殖健康聯(lián)合實驗室，共同申報國家十四五計劃生殖健康領(lǐng)域重點項目，擬對精子庫精子進(jìn)行更真實全面的篩選和評估，預(yù)計將為精子庫精子的受孕成功率提升十個百分點，致力于為適齡不孕不育人群解決生育難題，為可生育人群實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。

在中國癌癥發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)增長趨勢，癌癥的治療效果不令人滿意。腫瘤靶向藥物是癌癥治療的新希望，具有方便、見效快的特點，在臨床已表現(xiàn)出較大的優(yōu)勢，能顯著改善患者的生存質(zhì)量和延長患者的生存期，是癌癥治療的首先藥物，但靶向藥物的應(yīng)用面臨兩個主要問題，一是靶向藥物的適用性問題，其治療效果與患者的基因突變類型密切相關(guān)，需要通過腫瘤患者的基因突變檢測來篩選適用患者；二是靶向藥物的耐藥問題，一般靶向藥物使用幾個月即可出現(xiàn)耐藥，可能產(chǎn)生新的耐藥基因。因此盲目使用靶向藥物，可能只對少數(shù)患者有效，治療效果很差，而如果采用基因突變檢測來指導(dǎo)靶向藥物的個性化治療，并且在治療過程中通過對耐藥基因的檢測了解靶向藥物的療效變化進(jìn)一步指導(dǎo)靶向用藥，則患者的治療效果可明顯改善，同時可避免無效用藥，節(jié)約社會成本。顯然采用靶向藥物的個性化治療方案可使患者受益最多，但受現(xiàn)有技術(shù)檢測靈敏度和特異性的限制該方案目前還難以實現(xiàn)。由于目前的基因突變檢測靈敏度和特異性不夠高，大都以腫瘤組織為檢測標(biāo)本，但很多晚期癌癥病人不適合手術(shù)治療無法獲取組織樣本，而細(xì)針穿刺等方法取樣較痛苦，患者往往難以接受，另外，對于手術(shù)患者腫瘤組織樣本難以再次取樣獲得，因此治療監(jiān)測過程中會出現(xiàn)無樣可取的情況；同時由于檢測靈敏度和特異性不夠高，現(xiàn)有技術(shù)只能進(jìn)行單一突變檢測，不能同時檢測多種點突變，由于突變種類較多，臨床檢測操作繁瑣，工作量較大。本項目針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的缺點進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新，采用特殊的TB-ARMS基因突變檢測技術(shù)使基因突變檢測靈敏度和特異性較現(xiàn)有技術(shù)提高十倍以上，從而可以血液樣品為檢測對象，并且可同時檢測多種點突變，簡化了操作流程，節(jié)約了成本。 本項目的目的是開發(fā)可以血液和組織樣品為檢測對象的高靈敏度和特異性的基因突變檢測試劑盒，用于臨床指導(dǎo)靶向藥物的個性化用藥，并將其推廣應(yīng)用。

本項目產(chǎn)品為一種利用精漿piRNA作為生物標(biāo)志物檢測男性生殖功能障礙的體外診斷試劑盒，可用于男性不育的早期診斷、輔助診斷及預(yù)后判斷等。本項目產(chǎn)品具有檢出率高、早期性、靈敏性等特點，可應(yīng)用于各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)的男性生殖功能障礙臨床診斷。

藥物活性與毒性篩選試劑盒是李紅玉教授團(tuán)隊經(jīng)歷 15 年研發(fā)的一種快速，簡便，高效檢測藥品或健康食品活性與毒性篩選試劑盒。該技術(shù)利用國際認(rèn)可的能夠反映體內(nèi)活性與毒性的模式生物秀麗隱桿線蟲作為篩選工具，配合特殊染料，能夠快速檢測受試品活性與毒性，也可利用該技術(shù)對藥品進(jìn)行二次開發(fā)。具有獨立自主知識產(chǎn)權(quán)，已成功申請國家發(fā)明專利 5 項，美國專利 1 項。已為甘肅東方天潤公司和上海中華藥業(yè)提供優(yōu)質(zhì)服務(wù)，并成功完成藥品，化合物，保健食品的活性開發(fā)。該技術(shù)可以為藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)，制藥企業(yè)，醫(yī)藥研究院所，化合物合成機(jī)構(gòu)