01.成果簡介

CRISPR/Cas9是細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御系統。其工作原理是crRNA通過堿基配對與tracrRNA結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。經過研究，通過人工設計tracrRNA/crRNA，改造形成具有引導作用的sgRNA，可以引導Cas9蛋白在多種細胞的特定基因組位點上進行切割、修飾，并最終實現基因突變、插入或缺失。因此，CRISPR/Cas9系統已經被廣泛應用于基因編輯技術領域。

近年來，CRISPR/Cas9基因編輯系統在真核生物和原核生物中得到了廣泛的應用。在大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中，用一個載體表達cas9基因，同時由于革蘭氏陰性菌重組效率低，需要在這個載體上表達λ-RED重組酶；在另一個載體中表達sgRNA和用于同源重組的同源臂序列。兩個載體都轉入大腸桿菌中時，sgRNA介導Cas9蛋白切割基因組上特定序列，形成雙鏈斷裂，刺激同源重組的發生，從而實現基因編輯。

本項成果構建了適用于鹽單胞菌的基于CRISPR/Cas9的基因編輯系統。該系統由兩個載體組成：第一個載體表達Cas9基因，且不需要表達λ-RED重組酶，實際操作中不再需要誘導λ-RED重組酶的表達，簡化了步驟流程；第二個載體表達sgRNA，并含有用于同源重組的同源臂序列。從而實現了基因編輯。

本項成果的技術優勢包括：

（1）基因編輯時間由原有的20余天縮短到7-8天；

（2）N個基因編輯時間由原有的N個月縮短到3+5N天；

（3）無需表達λ-RED重組酶。

圖1 鹽單胞菌TD01進行基因編輯的流程示意圖

02.應用前景

本項成果可作為CRISPR/Cas9基因編輯系統的載體，廣泛應用于基因編輯領域。

03.知識產權

本項成果已申請1項發明專利。

04.團隊介紹

本項目為多團隊合作項目，其中一個團隊的負責人為清華大學教授，博士生導師，長江學者特聘教授，國家杰出青年基金獲得者。主要研究方向為合成生物學、微生物代謝工程、生物材料、工業生物技術。已發表國內外高水平學術論文數十篇，申請專利70余項。

05.合作方式

投融資。

06.聯系方式

郵箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn