近日，Plant Biotechnology Journal在線發(fā)表了中國農業(yè)大學王濤、董江麗團隊題為“Construction of genic male sterility system by CRISPR/Cas9 editing from model legume to alfalfa”的研究論文。該研究建立了利用高效基因編輯工具創(chuàng)制苜蓿隱性核不育系及其保持材料的方法。由于隱性核不育系作為雜交母本，對父本沒有特定恢復基因的要求，因此該系統(tǒng)能夠更為便捷地應用于苜蓿雜交育種制種。

紫花苜蓿 (Medicago sativa) 是全球最重要的豆科飼用作物，是奶業(yè)高質量發(fā)展的物質基礎，享有“牧草之王”的美譽。長期以來，苜蓿產業(yè)國際依存度高一直是制約我國畜牧業(yè)，特別是乳業(yè)發(fā)展的短板，我國常年從美國等發(fā)達國家進口苜蓿干草150萬噸左右，種子85%以上依賴進口，關鍵問題是育種技術和國際先進水平差距大。解決苜蓿種業(yè)“卡脖子問題”，實現(xiàn)苜蓿種業(yè)自立自強，種源自主可控，提高我國苜蓿種業(yè)競爭力一直是課題組的初心使命。

雜種優(yōu)勢利用是作物遺傳改良的重要方式，雜交種創(chuàng)制的核心在于控制授粉，其最佳解決方案就是采用雄性不育系。目前，紫花苜蓿雄性不育系材料非常有限，而且通過正向遺傳學尚未克隆到明確的雄性不育基因；同時，與不育系配套的保持系、恢復系材料篩選也非常困難。因此，創(chuàng)建紫花苜蓿系雄性不育系并實現(xiàn)三系配套是技術創(chuàng)新的主要方向。

研究人員首先在近緣模式植物截形苜蓿 (M. truncatula) 中通過反向遺傳學策略篩選雄性不育靶標基因并進行功能驗證。水稻中OsNP1、HTH1以及玉米中IPE1都屬于葡萄糖-甲醇-膽堿 (Glucose-Methanol-Choline, GMC) 氧化還原酶超家族基因，單基因純合突變能夠造成雄性不育表型，且不影響其他性狀。但是雙子葉植物中尚無該家族成員純合突變造成雄性不育的報道。研究人員對GMC氧化還原酶家族基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析和表達模式分析，發(fā)現(xiàn)截形苜蓿Medtr5g011020與已報道的雄性不育基因遺傳距離較近，在花蕾發(fā)育早期雄蕊中特異性高表達，推斷Medtr5g011020可能參與苜蓿雄性育性調控，將其命名為MtNP1。利用該課題組前期建立的苜蓿高效基因編輯工具 (Zhu et al., 2021, JXB) 構建突變材料，發(fā)現(xiàn)純合移碼突變體Mtnp1具有雄性不育表型。因此MtNP1可作為創(chuàng)制苜蓿雄性不育系的靶標。

圖1 截型苜蓿雄性不育基因篩選和功能驗證

課題組中利用苜蓿優(yōu)化的基因編輯工具靶向MsNP1，高效獲得紫花苜蓿栽培種突變體材料。所有轉基因陽性植株全部發(fā)生基因編輯 (16/16)，其中14/16為四等位均發(fā)生編輯，2/16為三等位發(fā)生編輯而保留一個野生型等位。表型分析發(fā)現(xiàn)，全部等位移碼突變的Msnp1突變體無成熟花粉粒，而雌性育性正常，是雄性不育系材料；同時，三等位雜合突變體能夠產生成熟花粉粒，可作為保持材料與全等位突變體進行姊妹交，后代能夠穩(wěn)定產生不育系基因型，并篩除外源轉基因片段。另外，MsNP1靶點基因組區(qū)段高度保守，因此該研究設計的雄性不育基因編輯方案適用于不同遺傳背景的紫花苜蓿材料，為擴大苜蓿雜交母本背景池提供了重要參考。

圖2 紫花苜蓿雄性不育系統(tǒng)創(chuàng)制

經過多年的努力，課題組利用高效基因編輯工具在苜蓿中快速建立隱性核不育系統(tǒng)，通過一次遺傳轉化同時獲得不育系和配套保持材料，并且該系統(tǒng)對恢復系無基因型要求，大大縮短雜交育種周期，為苜蓿雜種優(yōu)勢利用提供了重要的材料資源和方法論基礎。據悉，王濤團隊在國內外首次創(chuàng)立了簡便化、周期短、效率高的苜蓿“快捷三系法”雜種優(yōu)勢利用方法，并已獲得2個紫花苜蓿優(yōu)勢組合

中國農業(yè)大學生物學院農業(yè)生物技術重點實驗室王濤教授和董江麗教授為該論文的共同通訊作者，在讀博士生葉沁怡為該論文的第一作者。該研究得到山東省農業(yè)良種工程 (2019LZGC010)、國家重點研發(fā)計劃 (2019YFD1002701) 項目資助。

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13770